Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0119

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0119
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Создание набора прототипов изделий из биоискусственной костной ткани и модуляторов остеогенеза для регенеративной медицины
Докладчик
Мойсенович Михаил Михайлович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель: Создание биоискусственных аналогов элементов децеллюляризированной костной ткани, обладающих остеоиндуктивной и остеокондуктивной активностью, пригодных для восстановления поврежденных или утраченных фрагментов костей различной формы (трубчатых, губчатых, плоских, смешанных) и анатомического положения, а также усиление остеоиндуктивной активности биоискусственных субстратов за счет регулируемого локального выброса факторов, модулирующих остеогенную активность.

Задачи:
1. Создание на основе разработанных ранее методов экспериментальных образцов медицинских изделий:
2. Исследование структуры поверхности экспериментальных образцов медицинских изделий в водной среде и при дегидратации с применением современных микроскопических методов: сканирующая электронная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
3. Исследование особенностей деструкции разрабатываемых экспериментальных образцов медицинских изделий и исследование их механических свойств: модуль Юнга, предел текучести и предельное удлинение.
4. Оценка биологического действия разрабатываемых экспериментальных образцов медицинских изделий в соответствии с ГОСТ ISO 10993-11-2011. «Изделия медицинские. Часть 11. Исследование общетоксического действия». Определение влияния минерализации на адгезию, пролиферацию, жизнеспособность и скорость миграции клеток. Определение функциональной активности разрабатываемых экспериментальных образцов медицинских изделий. Изучение в экспериментах in vitro и in vivo остеиндуктивной и остеокондуктивной активности разрабатываемых экспериментальных образцов медицинских изделий.
Актуальность и новизна исследования
Быстрое и эффективное восстановление повреждений костной ткани – важнейшая задача современной ортопедии. Использование костных имплантатов является стандартным подходом при лечении травм, врожденных дефектов и заболеваний кости. Для фиксации костных отломков в лечении переломов используются пластины, спицы и штифты из нержавеющей стали, титана и др. сплавов. Поврежденная кость фиксируется как введением штифта внутрь кости, так и внешними фиксирующими элементами. Данный метод лечения имеет ряд существенных недостатков: часто необходима повторная операция для удаления имплантата, металл мешает исследованиям, необходимым для контроля процесса регенерации, длительное нахождение инородного тела неизбежно оказывает отрицательное влияние на трофику тканей; высокий модуль упругости металлов по сравнению с костью, приводит к перераспределению механической нагрузки с кости на имплант, что приводит к резорбции кости и изнашиванию импланта. Один из основных подходов при решении этой проблемы – создание биоискусственных аналогов костной ткани, являющихся биоактивным матриксом, позволяющим восстановиться собственной кости и разлагающимся по мере процесса восстановления. Скаффолды из фиброина шелка, разрабатываемые в проекте, являются не только каркасом, позволяющим закрыть место дефекта и/или зафиксировать ткани в области поражения, но и биологически активным матриксом, который привлекает разные типы аутологичных клеток организма и способствует их пролиферации и дифференцировке. Биокомпозитный материал на основе фиброина шелка с такими стимуляторами остеогенеза, как ВМР, позволят повысить его регенераторный потенциал до потенциала аутологичного костного материала или превысить его.
Описание исследования

Для изготовления экспериментальных образцов биорезорбируемых минерализованных пористых скаффолдов на основе фиброина шелка использован метод выщелачивания с использованием кристаллов хлорида натрия в качестве преобразователя диаметром не менее 100 мкм и не более 500 мкм. Экспериментальных образцы биорезорбируемых минерализованных бислойных скаффолдов на основе фиброина шелка получены из конструкций, представляющей собой пористую фиброиновую губку, изготовленную путем замораживания-оттаивания раствора фиброина на пленке, сформированной в результате кастинга водного раствора фиброина фиброина. Экспериментальные образцов биорезорбируемых минерализованных микрочастиц на основе фиброина шелка будут изготовлены из микроскаффолдов, полученных путем криоизмельчения пористых фиброиновых скаффолдов, сформированных методам замораживания-оттаивания водного раствора фиброина. Минерализация СаР биорезорбируемых пористых скэффолдов, бислойных скэффолдов и микрочастиц проведена осаждением фосфатов кальция из насыщенных растворов солей в 2 этапа. Изготовление экспериментальных образцов биодеградируемой полимерной фиксирующей пленки, армированной хирургическими нитями проведена путем кастинга водного раствора фиброина шелка. На этапе формирования пленки в раствор будут упорядоченно погружены хирургические шелковые нити, что позволит улучшить механические свойства получаемой полимерной пленки путем армирования, сохраняя при этом полимерный состав изделия. Исследование структуры поверхности экспериментальных образцов изделий из биоискусственной костной ткани в водной среде проводиться с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), при дегидратации с применением сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии. Исследование скорости деструкции экспериментальных образцов изделий из биоискусственной костной ткани выполняется в нейтральной среде – фосфатно-солевом буфере и окисляющих условиях – реактиве Фентона. Исследование адгезии и пролиферации фибробластов на экспериментальных образцах изделий выполняется двумя способами с использованием МТТ-теста и путем количественного подсчета с применением КЛСМ. Жизнеспособность клеток при культивировании на экспериментальных образцах изделий из биоискусственной костной ткани оценивается с помощью подсчета живых и мертвых клеток с применением КЛСМ. 

Для обеспечения остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств, а также удобства эксплуатации при клиническом применении разрабатываемого изделия будет проведено конструирование фармацевтической формы биоматериала – пасты для заполнения костных дефектов. В качестве основы формы предполагается использование микросфер из ПОА, которые будут выполнять функцию каркаса для роста клеток, биодеградируемого наполнителя дефектов костной ткани и носителя для биоактивных остеоиндуктивных веществ. 

Проведение оценки острой токсичности экспериментальных образцов изделий из биоискусственной костной ткани будет проводиться в течение 72 часов при подкожной имплантации по следующим параметрам: число павших животных и сроки их гибели, изменение массы тела, потребление пищи и воды, изменения поведенческих реакций, патологические изменения в тканях и внутренних органах,  выявляемые при аутопсии павших и выживших животных. Остеогенная активность созданной биоискусственной костной ткани и модуляторов остеогенеза будет исследована на мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСК), выделенных из костного мозга. Активность будет оцениваться по уровню экспрессии ключевых генов, вовлеченных в остеогенез (ALP, остеокальцина и коллагена 1-го типа) методом ПЦР в реальном времени. Исследование функциональной активности экспериментальных образцов изделий из биоискусственной костной ткани будет проведено в модельной системе травмы бедренной кости крысы с применением рентгенологических и гистохимических методов. Скорость регенерации костной ткани будет оценена путем определения индекса регенерации костной ткани (РКТ).

В ходе осуществления экспериментальных исследований будет происходить отработка и коррекция методов изготовления изделия на основе новых данных, полученных на каждом этапе работы. С этой целью, например, помимо разработки самого метода изготовления пасты в дальнейшем отработка и коррекция метода осуществляется на каждом этапе на основании результатов экспериментального исследования изделия.

Результаты исследования

Регенерация костной ткани – сложный процесс, в котором задействованы различные типы клеток, сигнальные молекулы и белки межклеточного матрикса [Moisenovich M.M., 2014]. Наиболее перспективных является использование скаффолдов (биополимерных каркасов), имитирующих структуру ткани, для восстановления обширных повреждений в том числе костной ткани [Vepari C., 2007]. Фиброин шелка Bombyx mori в силу своих уникальных физико-химических и биологических свойств позволяет создавать на его основе разные типы биорезорбируемых пористых скаффолдов. Кроме того, фиброиновые изделия обладают высокой биосовместимостью, низкой иммуногенностью, контролируемой биодеградацией и ограниченной бактериальной адгезией [Moisenovich M.M., 2014]. Биополимеры на основе шелка кокона шелкопряда прекрасно изучены, что связано с доступность материала и многолетним опытом его применения в медицинских целях в качестве шовного материала. Источником полимеров обычно служат коконы шелкопряда Bombyx mori [Kundu B, 2013]. При выполнении 1 и 2 этапов проекта на основе фиброина шелка были разработаны научные и технологические основы создания биоискусственных аналогов элементов децеллюляризированной костной ткани, обладающих остеоиндуктивной и остеокондуктивной активностью, пригодных для восстановления поврежденных или утраченных фрагментов костей, а также усиление остеоиндуктивной активности биоискусственных субстратов за счет регулируемого локального выброса факторов, модулирующих остеогенную активность. В результате установлены способы создания экспериментальных образцов и методы дальнейшего исследования их структуры, механических и биологических свойств. В соответствии с разработанной научно-технической документацией созданы экспериментальные образцы биорезорбируемых минерализованных пористых скаффолдов методом выщелачивания с использованием кристаллов хлорида натрия в качестве поробразователя диаметром 100-500 мкм, экспериментальные образцы биорезорбируемых минерализованных бислойных скаффолдов, представляющие собой пористую фиброиновую губку, изготовленную путем замораживания-оттаивания раствора фиброина на пленке, сформированной в результате кастинга водного раствора фиброина, экспериментальные образцы биорезорбируемых минерализованных микрочастиц на основе фиброина изготовлены из микроскаффолдов, полученных путем криоизмельчения пористых фиброиновых скаффолдов, сформированных методам замораживания-оттаивания водного раствора фиброина, экспериментальные образцы биодеградируемой полимерной фиксирующей пленки, армированной фиброиновыми нитями, и экспериментальные образцы пасты из биодеградируемого микрогранулярного остеоиндуктивного биоматериала на основе полиоксиалканоатов (ПОА), содержащего ростовой фактор BMP-2. Полученные экспериментальные образцы стабильны как в нейтральных, так и в окисляющих условиях в экспериментальных системах in vitro, являются биосовместимыми: поддерживают адгезию, пролиферацию и жизнеспособность как иммортализованных, так и первичных культур клеток, участвующих в регенерации.

Практическая значимость исследования
В результате выполнения проекта в целом набор изделий для ускорения заживления и регенерации костной ткани. Результаты выполненного проекта будут востребованы в сфере здравоохранения, т.к. возвращение к нормальной жизни и сокращение сроков реабилитации больных после перенесённых заболеваний и хирургических операций, связанных с повреждений и/или утратой фрагментов костной ткани, является весьма важной и актуальной проблемой. Решение её во многом зависит от разработки материалов, предназначенных для замещения или регенерации тканей или целиком поврежденного органа. Проведение планируемой работы, ориентированной на создание отечественных медицинских изделий на основе биорезорбируемых материалов, позволит решить проблему импортозамещения дорогостоящих зарубежных аналогов. Создание медицинских изделий на основе биорезорбируемых материалов с улучшенными по сравнению с зарубежными аналогами свойствами, позволит повысить качество здоровья населения за счет уменьшения вероятности наступления осложнений и отторжений после операции. Восстановление поврежденных костных фрагментов, экономия средств на лечение больных за счет снижения расходов и уменьшения времени лечения, снижение инвалидизации населения будут также иметь положительный экономический эффект. Внедрение новых материалов и технологий для изготовления медицинских изделий будет способствовать модернизации отечественной медицинской промышленности.
Разработанные методы получения образцов изделий будут экономически целесообразными, что даст возможность замены импортных реактивов и расходных материалов на отечественные аналоги, а также позволит создать принципиально новые медицинские изделия. Успех реализации предложенной тематики позволит существенно увеличить объем российского рынка имплантируемых материалов, который на данный момент составляет около 30 миллиардов рублей в год (по данным открытых источников в сети Интернет). При благоприятных условиях имеется шанс занять позиции на пока еще формирующемся мировом рынке изделий для заместительной хирургии и тканевой инженерии, объем которого, по данным BCC Research, в 2014 году составлял 43 миллиарда долларов и имеет потенциал роста более 10 процентов в год.