Регистрация / Вход
Прислать материал

14.579.21.0017

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.579.21.0017
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов"
Название доклада
Разработка технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий медицинского назначения на основе рекомбинантных белков паутины
Докладчик
Дебабов Владимир Георгиевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является разработка технологии получения новых биосовместимых, биодеградируемых гидрогелевых изделий медицинского назначения на основе рекомбинантных белков паутины, которые в виде гидрогеля и микрогеля будут востребованы в качестве материала для регенера-тивной медицины, в лечении глубоких ожогов и пролежней, а также в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей.
Задачи проекта:
- Провести патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.
- Осуществить масштабирование методов получения рекомбинантных белков паутины и меди-цинских изделий на его основе в виде биорезорбируемых гидрогелей и микрогелей.
 Разработать опытно-промышленные регламенты (ОПР) получения микробным синтезом ре-комбинантных белков паутины и биорезорбируемых гидрогеля и микрогеля на их основе.
 Получить экспериментальные образцы рекомбинантных белков паутины, гидрогеля и микрогеля на их основе и провести испытания их физико-химических и медико-биологических свойств.
 Провести технические, санитарно-химические испытания и токсикологические исследова-ния, в том числе определение общей токсичности, исследование местно-раздражающего, аллерген-ного и сенсибилизирующего действия экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля.
 Провести технико-экономическую оценку рыночного потенциала полученных результатов.
 Разработать рекомендации и предложения по использованию результатов ПНР в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
 Разработать проект технического задания на проведение последующей ОКР.
Актуальность и новизна исследования
Актуальность проекта определяется возрастающей необходимостью перехода от устаревшей методологии трансплантологии - использования донорских органов к идеологии использования для этих целей биоискусственных биологических органов и тканей, а также высокой социально-экономической значимостью, так как применение разрабатываемых медизделий снизит необходи-мость хирургических вмешательств и время реабилитации, уменьшит количество инвалидов.
Ускорение заживления ран и прочих повреждений путем стимуляции регенерации является одной из важнейших задач практической медицины. Регенерация поврежденных тканей зависит от пролиферации в зоне поражения клеток различных типов и синтеза как собственных элементов, так и компонентов межклеточного вещества.
Разрабатываемые в проекте медицинские изделия в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомби-нантного белка паутины, способные, как было показано нами, вызывать активную адгезию и пролифе-рацию клеток, иннервацию и васкуляризацию в зоне дефекта, являются материалами, соответствующи-ми трендам научно-технического развития в области регенерации тканей и лечения ожогов и ран. Они могут быть наиболее востребованы в качестве имплантатов для замещения дефектов мягких и костных тканей, а также в лечении глубоких ожогов и ран.
Научная и научно-техническая новизна заключается в создании впервые в нашей стране промышленно значимой технологии получения биосовместимых биоразлагаемых материалов белковой природы для целей регенеративной медицины.
Описание исследования

Для получения очищенного белка – рекомбинантного спидроина 1F9 (РС) был разработан лабораторный регламент выделения и очистки, который включал в себя стадии сбора и разрушения клеток дрожжей Saccharomices cerevisiae с помощью шаровой мельницы, сбора центрифугированием водонерастворимой клеточной фракции, экстракции искомого белка из этой фракции с помощью раствора  лития хлористого в уксусной кислоте, диализа полученного раствора с последующей ионообменной хроматографией на катионите и элюцией градиентом концентрации хлористого натрия. Полученный раствор диализовали против деионизованной воды, замораживали и высушивали лиофильно.

Были разработаны лабораторные регламенты получения гидрогеля (ГГ) из 3%-ного раствора РС, получаемого путем растворения белка в водных растворах солей, и микрогеля (МГ), получаемого  путем физического дробления ГГ, и исследовано влияние температуры, присутствия спирта, солей на скорость образования гидрогеля.

Исследовательские испытания (ИИ) отдельных операций изготовления экспериментальных образцов РС, а также  технических и физико-химических свойств экспериментальных образцов, проводившиеся в соответствии с разработанной Программой и методиками  (ПМ), включали в себя определение: внешнего вида, стерильности, электрофоретической чистоты, молекулярной массы, коэффициента экстинкции, способности образовывать нити при экструзии раствора в спирт.

В соответствии с ГОСТ разрабатывали способы упаковки, маркировки и стерилизации субстанции РС, ГГ и МГ. Ввиду того, что стерилизация с помощью автоклавирования и гамма-облучения (15 кГр) приводили к разрушению структуры ГГ, был использован способ стерилизации путем тиндализации – трехкратного повторения процедур нагревания до 900С с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение суток.

ИИ экспериментальных образцов ГГ и МГ проводили в соответствии с разработанной ПМ и включали в себя исследование следующих технических, физико-химических и медико-биологических свойств: концентрация  РС, содержание воды, устойчивость к гидролитической деструкции, химическая стабильность в растворах слабых кислот и щелочей; морфология и нано-/микроструктура, способность к адгезии и поддержке пролиферации эукариотических клеток in vitro, способность к поддержанию жизнеспособности клеток при культивировании;  устойчивость к деградации в фосфатно-солевом буфере при нейтральном рН, а также в реактиве Фентона; способность к обеспечению васкуляризации и иннервации in vivo (на модельной системе полнослойной раны кожи мыши при интрадермальном введении и поверхностном нанесении). При анализе взаимодействия с клетками были использованы разработанные нами ранее модельные системы с применением конфокальной микроскопии, позволяющие исследовать внутреннюю структуру ГГ и МГ без нарушения их пространственной организации. Для прижизненного наблюдения за адгезией клеток на поверхности и стенках пор ГГ и МГ, а также пролиферацией и жизнеспособностью клеток использовали витальные органо-специфичные маркеры и трейсеры.

При масштабировании процессов подготовки посевного материала, культивирования штамма-продуцента,   экстракции,  очистки и лиофилизации РС, получаемого  в 100-л ферментере, получения ГГ и МГ, использовали те же подходы, что и в лабораторной методике, за исключением того что вместо процесса диализа в лабораторном варианте, при масштабировании процессов выделения и очистки РС была разработана технология ультрафильтрации растворов рекомбинантного белка. на пористых мембранах.

Технические испытания (определение внешнего вида, цвета, запаха, водородного показателя рН, вязкости динамической при скорости сдвига 10 с-1, растворимости и стерильности), санитарно-химические испытания (наличие в водной вытяжке из изделий восстановительных примесей (окисляемых веществ),  изменение величины рН вытяжки,  ультрафиолетовое поглощение в вытяжке) и токсикологические исследования, в том числе, определение общей токсичности (на крысах), исследование местно-раздражающего, аллергенного и сенсибилизирующего действия (на кроликах и морских свинках) экспериментальных образцов ГГ и МГ по оценке биологического действия разработанных изделий проводились в соответствии с Правилами государственной регистрации медицинских изделий и в соответствии с ГОСТ ISO 10993-2011.

По результатам испытаний разработано регистрационное досье на изделия медицинского назначения в виде ГГ и МГ на основе рекомбинантного спидроина для представления в Минздрав России.

Результаты исследования

Проведено масштабирование процессов  экстракции,  очистки и лиофилизации рекомбинатного  спидроина, получаемого  в 100-л ферментере, и процессов изготовления гидрогеля и микрогеля на его основе и разработаны соответствующие разделы проекта ОПР. Разработана Программа и методики исследовательских испытаний масштабированных операций изготовления субстанции рекомбинантного спидроина, гидрогеля и микрогеля и их экспериментальных образцов. Наработаны экспериментальные образцы биомассы штамма-продуцента рекомбинантного спидроина по масштабированной технологии в 100 л ферментере.

Экспериментальные образцы гидрогеля и микрогеля имеют нано-, микро- и макропористую структуру и обеспечивают эффективную адгезию, пролиферацию и жизнеспособность эукариотических клеток при культивировании, а также стимулируют иннервацию и неоваскуляризацию вновь образованных тканей in vivo.

Проведены технические, санитарно-химические испытания и токсикологические  исследования экспериментальных образцов гидрогеля и микрогеля и показано их полное соответствие требованиям ТЗ, а также отсутствие общей токсичности, местно-раздражающего, аллергенного и сенсибилизирующего действия.

Проведены исследования технических, физико-химических и биологических свойств экспериментальных образцов рекомбинантного спидроина,  гидрогеля и микрогеля, полученных по масштабированной технологии. Показано полное соответствие тестированных параметров заявленным в ТЗ и свойствам образцов получаемых по лабораторным реглкмаентам. Разработаны проект ОПР получения рекомбинатного спидроина и ОПР получения гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантного спидроина. Разработаный проект ОПР получения рекомбинатного спидроина позволяет получать в среднем более 350 г/л биомассы и более 3,5 г белка на кг влажной биомассы.

Разработан проект ТЗ на ОТР «Разработка опытно-промышленной технологии получения субстанции рекомбинатного спидроина, гидрогеля и микрогеля на его основе». Произведена корректировка проектов ТУ.  Разработано технико-экономическое обоснование разработки продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - Центра трансфера биотехнологий Ока-Биотех.

Разработано регистрационное досье на изделия медицинского назначения в виде гидрогеля и микрогеля на основе рекомбинантных белков паутины для представления в МЗ РФ.

Все поставленные в ТЗ задачи выполнены полностью, а все полученные результаты находятся в пределах интервалов, заданных в ТЗ для этих показателей. Результаты выполняемой ПНИ находится на мировом уровне и не уступает лучшим достижениям в данной области. Разработанная технология является основой для масштабированного производства новых биосовместимых биодеградируемых материалов в виде гидрогелей и микрогелей, обеспечивающих создание новой высококонкурентной продукции медицинского назначения.

 

Практическая значимость исследования
Область применения полученных результатов – реконструктивная медицина: создаваемые в рамках проекта технология получения новых материалов на основе рекомбинантных аналогов природных спидроинов станут основой для использования их в качестве покровного материала для лечения ожогов и ран, имплантатов в восстановительной и заместительной хирургии, сердечно-сосудистой хирургии, нейрохирургии, офтальмохирургии и ортопедии, для трансплантации клеток и тканевой инженерии. Полученные на этапе результаты лягут в основу технологии производства биосовместимых биодеградируемых гидрогеля и микрогеля, предназначенных для использования в медицине. Результаты будут использованы ООО «ОКА-Биотех» (Производственный партнер) для организации производства рекомбинантного спидроина, гидрогеля и микрогеля на его основе.
Успешное осуществление проекта позволит создать отечественную базу для производства биосовместимых материалов нового типа, что позволит в будущем не зависеть от закупок за рубежом дорогих аналогов тех технических средств или технологий биоматериалов, в которых будут реализованы результаты данных исследований. Планируемые к выпуску препараты позволят сократить сроки лечения и облегчить период выздоровления.
Полученные результаты в виде медицинских изделий – гидрогеля и микрогеля для лечения ран и ожогов, имплантатов в восстановительной и заместительной хирургии будут коммерциализированы. Мировой рынок биосовместимых материалов в последние годы имеет устойчивую динамику роста в 10,3 %. ежегодно и по прогнозу в 2015 году составит порядка $31,9 млрд. В РФ этот рынок оценивается в 100 млн $ при отсутствии доступных качественных отечественных продуктов. Разрабатываемые изделия могут занять 10% такого рынка.