Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0072

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0072
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"
Название доклада
Разработка технологии получения полимерных форм препаратов для лечения онкологических заболеваний
Докладчик
Гукасова Надежда Вадимовна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта - разработка технологии получения и создание экспериментальных образцов полимерных форм препаратов (этопозида и никлозамида) и исследование их противоопухолевой активности и общего токсического действия. Основные задачи проекта: разработка оптимального состава и подбор оптимальных технологических параметров получения полимерных форм препаратов (ПФП) в том числе с использованием микрофлюидных технологий; разработка методов анализа качества и лабораторных регламентов получения ПФП; исследование противоопухолевой активности ПФП in vitro и in vivo; исследование механизмов действия ПФП; исследование общетоксических свойств ПФП in vivo; исследование основных параметров фармакокинетики ПФП; исследование стабильности ПФП в условиях хранения.
Актуальность и новизна исследования
Научная проблема, на решение которой направлен реализуемый проект - разработка полимерных форм препаратов для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований. Известно, что химиотерапевтические методы лечения злокачественных опухолей затруднены низкой специфичностью действия и, как следствие, высоким уровнем побочных эффектов большинства противоопухолевых препаратов. Кроме того, существенно ограничивает возможности химиотерапии множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, обусловленная в том числе гиперэкспрессией трансмембранных белков семейства ABC-транспортеров. Полимерные системы доставки противоопухолевых средств на основе нано- или субмикронных частиц можно рассматривать в качестве перспективного подхода повышения эффективности и безопасности противоопухолевых препаратов. Полимерные системы доставки на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) характеризуются биосовместимостью, способностью защищать лекарственное вещество от быстрой деградации; способностью повышать селективность транспорта лекарственного средства и снижать неспецифическую побочную токсичность; способностью оптимизировать фармакокинетику, обеспечивать пролонгированное действие лекарственного вещества и преодолевать лекарственную устойчивость; пригодностью для различных способов введения; стабильностью. Новизна решений проекта заключается в разработке технологии получения полимерных форм препаратов, в том числе с применением микрофлюидной технологии, а также улучшенных характеристиках разработанных препаратов по критериям безопасности и эффективности, по сравнению с прототипами и аналогичными российскими и мировыми разработками.
Описание исследования

В основу процесса получения ПФП были положены лабораторные методы эмульгирования многокомпонентных водно-органических систем с последующим упариванием органического растворителя и высушиванием замороженной водной реакционной смеси путём лиофилизации. Для достижения оптимальных параметров проводились экспериментальные исследования, связанные с подбором и оптимизацией технологических параметров получения ПФП: подбор оптимального состава полимерсодержащей композиции, в том числе выбор типа полимера (PLGA 50/50, PLGA-COOH, PLGA 75/25, PLA, смесь PLGA 50/50 и эудрагита RL или RS), выбор стабилизатора эмульсии, подбор соотношение полимера и ПАВ, подбор оптимальных условий технологического процесса. Отработаны условия получения ПФП с использованием микрофлюидной технологии (микрореакторной установки Qmix) при варьировании различных условий: концентрации раствора полимера (PLGA50/50), скорости подачи раствора полимера и поливинилового спирта. Наработаны образцы ПФП разного состава для выбора перспективного образца. Перспективный образец был получен многократно для подтверждения воспроизводимости метода его получения статистически достоверными данными.

Анализ полученных образцов ПФП проводился различными физико-химическими методами. Разработаны методики анализа образцов полимерной формы этопозида (Этопозид-ПФ) по показателям качества: описание, растворимость, подлинность, количественное определение этопозида, размер частиц, содержание примесей, остаточные органические растворители, рН, вода, суспендируемость. Проведена валидация метода количественного определения этопозида в полимерной форме при помощи ВЭЖХ с использованием валидационных тестов: сходимость, специфичность, линейность, точность, предел обнаружения и предел количественного определения. Разработаны методики анализа образцов полимерной формы никлозамида (Никлозамид-ПФ) по показателям качества: описание; растворимость; подлинность; суспендируемость; размер частиц; рН; вода; количественное определение; посторонние примеси; остаточные органические растворители. Проведена валидация метода количественного определения никлозамида в полимерной форме при помощи ВЭЖХ с использованием валидационных тестов: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы. Для исследования стабильности образцов ПФП в условиях хранения образцы закладывались на хранение (срок - 1 год) и анализировались в контрольных временных точках на соответствие показателям качества, заложенным в методиках анализа качества ПФП.

Разработаны модельные клеточные тест-системы для исследования противоопухолевой активности ПФП in vitro на стандартизованных клеточных линиях с использованием методик учета выживаемости и клоногенности. Для исследования противоопухолевой активности Этопозида-ПФ выбраны следующие модельные линии: чувствительная и резистентная сублинии клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 и MCF-7ADR, чувствительная и резистентная сублинии клеток миелолейкоза человека линии К562 и К562ADR, лимфолейкоз мыши линии Р388, аденокарцинома ободочной кишки линии Сасо-2, аденокарцинома прямой кишки линии SW837 и карцинома ободочной кишки линии COLO 320HSR. Для исследовании противоопухолевой активности Никлозамида-ПФ выбраны следующие модельные линии: линии COLO 320HSR и MCF-7, меланома мыши линии B16, аденокарцинома молочной железы мыши линии Са755. Для оценки токсического воздействия препаратов на нормальные клетки в качестве модельных были выбраны линии LECH-4 и НЕК 293. При исследовании механизмов противоопухолевого действия Никлозамида-ПФ in vitro применялись методы анализа клеточного цикла, апоптоза, повреждения ДНК, оценки влияния на множественную лекарственную устойчивость.

При исследовании противоопухолевой активности ПФП in vivo использовались модели перевиваемых опухолей мышей с оценкой степени торможения опухолевого роста и увеличения продолжительности жизни животных, выбором оптимальной схемы применения и диапазона терапевтических доз, сравнительным изучением эффективности ПФП и свободных субстанций.

При исследовании общетоксических свойств ПФП in vivo в экспериментах на мышах  определялись диапазоны летальных и переносимых доз при различных способах однократного введения, а также изучалась переносимость курсового введения ПФП. 

При исследовании фармакокинетики ПФП in vivo проводилась оценка основных параметров фармакокинетики ПФП в сравнении со свободными субстанциями.

Результаты исследования

Разработаны лабораторные регламенты получения препаратов Этопозид-ПФ и Никлозамид-ПФ и проведена наработка трех партий образцов Этопозида-ПФ и двух партий - Никлозамида-ПФ. Препараты представляют собой частицы (средний размер частиц не больше 500 нм) в виде лиофилизатов для приготовления суспензии. Состав Этопозид-ПФ: этопозид – от 5.0 до 8.0 % масс, вспомогательные вещества - полимер PLGA 50/50, поливиниловый спирт, D-маннитол. Состав Никлозамид-ПФ: никлозамид 4.0-7.0% масс, вспомогательные вещества - PLGA 50/50, Eudragit RS PO, ПВС, D-маннитол. При исследовании стабильности препаратов показано, что образцы выдержали испытание по показателям контроля качества в течение 1 года.

При исследовании противоопухолевой активности Этопозида-ПФ in vitro, обнаружено, что активность препарата была в зависимости от типа клеток либо близка к субстанции этопозида, либо превышала активность субстанции. Этопозид-ПФ проявлял высокую противоопухолевую активность in vivo на модели лимфолейкоза мышей Р388 (при п/к, в/б и в/в путях введения). Торможение роста опухолей превышало 80%, увеличение продолжительности жизни превышало 100%, оптимальная курсовая доза 75-90 мг/кг. При исследовании общетоксических свойств Этопозид-ПФ in vivo на мышах установлено, что значения ЛД50 составили 129.6 мг/кг при в/в введении, 172.7 мг/кг при в/б введении. Показано, что Этопозид-ПФ менее токсичен и лучше переносится по сравнению с субстанцией этопозида и препаратом сравнения Этопозид.

При исследовании противоопухолевой активности Никлозамида-ПФ in vitro обнаружено, что препарат обладает более высокой активностью, чем свободный никлозамид, в том числе в отношении опухолевых клеток, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью за счет экспрессии АВС-транспортеров ABCB1. Комбинированное применение с цисплатином (ЦП) показано, что комбинация эффективна в отношении исследованных линий опухолевых клеток. Обнаружен синергизм или аддитивное действие активности Никлозамид-ПФ в комбинации с ЦП. При исследовании механизма действия Никлозамида-ПФ показано, что препарат ингибировал накопление родамина-123 в опухолевых клетках, что свидетельствует о повреждающем действии на митохондрии клеток. Никлозамид-ПФ стимулировал образование активных метаболитов кислорода в клетках. При действии препарата были обнаружены двунитевые разрывы ДНК и блок клеточного цикла в фазе G0/G1. В ходе испытаний противоопухолевой активности in vivo на моделях меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы мыши Са755 при в/б введении было обнаружено, что препарат проявлял выраженную противоопухолевую активность: торможение роста опухолей 60-100%; оптимальная разовая доза 20 мг/кг, оптимальная курсовая доза 160-220 мг/кг. В ходе испытаний с применением схем комбинированной терапии с ЦП было обнаружено, что препарат повышает эффективность лечения: торможение роста опухоли достигало 75%. При исследовании общетоксических свойств Никлозамида-ПФ in vivo на мышах установлено, что значения ЛД50 составили 92.8 мг/кг при в/б введении и  более 1700 мг/кг при в/ж введении. Сравнение данных по острой токсичности показало, что Никлозамид-ПФ является менее токсичным средством, чем субстанция никлозамида.

При исследовании фармакокинетики Этопозида-ПФ и Никлозамида-ПФ показано изменение фармакокинетического профиля препаратов по сравнению со свободными субстанциями, обеспечивающее пролонгированное нахождение препаратов в кровеносном русле.

Практическая значимость исследования
Основные направления применения полученных результатов проекта включают в себя проведение опытно-конструкторских работ, расширенных доклинических исследований, организацию производственной площадки, в связи с чем, совместно с индустриальным партнером (ОАО "Мосхимфармпрепараты" им. Н.А. Семашко") разработан проект технического задания на проведение опытно-конструкторских работ по разработке технологии и доклиническим исследованиям перспективного противоопухолевого препарата (Этопозид-ПФ). Внедрение разработанного препарата в клиническую практику позволит значительно повысить эффективность лечения онкологических заболеваний и снизить риск смертности. Важными социально-экономическими эффектами использования результатов проекта является улучшение потребительских свойств создаваемой продукции и повышение ее конкурентоспособности. Значимым эффектом реализации проекта является повышение производительности технологических процессов за счет применение микрофлюидных технологий. Предполагаемая коммерциализация результатов интеллектуальной деятельности, полученных в рамках проекта, заключается в заключении лицензионного договора с индустриальным партнером на полученные и зарегистрированные РИД. С участием индустриального партнера могут быть проведены клинические исследования, а также организовано производство, реализация и медицинское применение продукции на территории Российской Федерации. Перспективность коммерческой реализации проекта определяется потребностью в разрабатываемом лекарственном препарате со стороны лечебных учреждений онкологического профиля.