Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0016

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0016
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Разработка биотехнологии получения антимикробного пептида цекропина Р1 на основе биобезопасных трансгенных растений каланхоэ перистого
Докладчик
Захарченко Наталья Сергеевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы было создание биотехнологии биосинтеза антимикробного пептида цекропина Р1 в растениях каланхоэ перистого, позволяющих переходить к созданию на их основе новых антибиотических препаратов фармацевтического и зооветеринарного назначения.
Научно-техническая цель работы заключалась в разработке лабораторной технологии получения экспериментальных образцов лекарственной субстанции из трансгенных растений каланхоэ перистого и разработки биологических испытаний на животных моделях.
В задачи исследования входило:
1. Разработка лабораторного технологического регламента получения экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого.
2. Получение и наработка экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ перистого.
3. Исследовательские испытания антимикробного, ранозаживляющего и иммуностимулирующего действия экспериментальных образцов экстрактов на животных.
4. Исследование устойчивости экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к высокой температуре, длительному хранению и консервантам.
5. Разработка лабораторного технологического регламента получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого.
6. Получение и наработка экспериментальных образцов АМП цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого.
7. Изучение факторов деградации цекропина Р1 при получении и хранении экстракта
Актуальность и новизна исследования
Не смотря на то, что мировой рынок антибактериальных препаратов – антибиотиков оценивается в год примерно в 30 миллиардов долларов, пептидные антибиотики на мировом и российском рынке в настоящее время практически не присутствуют. Пептидные антибиотики (АМП, антимикробные пептиды) имеют существенные преимущества перед другими известными антимикробными агентами. Имея беспрецедентную удельную активность, они могут применяться в сверхнизких концентрациях (~10 нМ), что в среднем в 10 000 раз ниже дозировок традиционных антибиотиков. В этом случае удается практически полностью исключить побочную токсичность для человека. Патогены не способны к быстрой выработке устойчивости к мембранотропным пептидам, чем выгодно отличаются от традиционных антибиотиков.
АМП цекропин Р1 активен против многих патогенных микроорганизмов человека и животных, что делает его перспективным лекарственным средством для борьбы с ожогами, трофическими язвами и воспалениями.
Новизна исследования заключается в том, что при использовании лекарственных трансгенных растений каланхоэ, экспрессирующих АМП цекропин Р1, проблема биосинтеза цекропина Р1 впервые полностью решена. Преимущества растений перед другими системами экспрессии заключаются в том что они полностью резистентны к действию цекропина Р1 и способны накапливать пептид в высоких концентрациях (свыше 10 мкг на 1 г влажной биомассы листьев). Кроме того, растения каланхоэ и полученный из них сок обладают собственной антибиотическими и ранозаживляющими свойствами.
Описание исследования

Технической задачей данного проекта являлось создание эффективного способа получения растительных экстрактов каланхоэ перистого с высокой антимикробной активностью. Поставленная техническая задача решалась методом получения водного экстракта из растительного сырья, включающего предварительную консервацию сырья в темноте при пониженной температуре (3-4°С в течение 7-12 суток), измельчении в лабораторном гомогенизаторе, экстракцией дистиллированной водой, отжиме, центрифугировании и прогревании при 65-70°С в течении часа, стерилизации через мембранный фильтр и добавлении консерванта 0,5% хлороформа.

Проводили анализ трансгенных растений на наличие антибиотической активности методом диффузии в агар растительных экстрактов. Для этого использовали чашки Петри, содержащие 30 мл 1,5%-ного агара с клетками энтеробактерии Erwinia carotovora (108 клеток/мл). В лунки, сделанные в агаре (диаметром 5 мм), добавляли экстракты трансгенных растений. Чашки выдерживали 8 ч при 4°С для диффузии экстракта в агар, а затем инкубировали при 25°С в течение суток. Радиус зоны просветления бактериального газона вокруг лунки служил показателем ингибирования роста бактерий.

Проводилось исследование эффективности антимикробного, ранозаживляющего и иммуностимулирующего действия экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ перистого на животных.

Была исследована устойчивость экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к высокой температуре. Для этого образцы экстрактов кипятили от 10 до 60 минут и проверяли антибиотическую активность методом диффузии в агар против патогенных микроорганизмов.

Проводилось исследование устойчивости экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к длительному хранению. Для этого использовали метод «ускоренного старения». Экстракт каланхоэ хранили в термостате при температуре 40°С в течение 3 месяцев, затем проводили исследование стабильности экстракта.

Проводилось исследование устойчивости экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к консервантам. В работе исследовали следующие консерванта: спирт 24%, натрия сульфита 1%, натрия метабисульфита 1%, молочная кислота 1%, лимонной кислота 1%, хлороформ 0,5-1%.

Для получения экспериментальных образцов АМП цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого брали 9 кг молодых листьев и выделяли экстракт. Полученный экстракт высаливали 80% сульфатом аммония и диализовали. Очищенный от пигментов и низкомолекулярных веществ препарат подвергали последовательно гель-фильтрации на колонках с разными сорбентами - Sephadex G-50 и Superdex Peptide (HR 10/30). Хроматографические фракции анализировали на антибиотическую активность. Очищенный препарат исследовали методом аналитической HPLC и с помощью масс-спектрометрии.

Изучение факторов деградации цекропина Р1 при получении и хранении экстракта проводилось по таким параметрам, как использование оптимального консерванта и наличие в препарате эндогенных протеиназ.

Результаты исследования

Разработан лабораторный регламент получения экстракта трансгенных растений каланхоэ, включающий: 1) Выдерживание растительной биомассы при пониженной температуре (+4°С) 7 суток; 2) Гомогенизация растительной биомассы с экстрагентом; 3) Осветление экстракта центрифугированием; 4) Прогревание супернатанта при 70°С; 5) Стерилизация образцов экстракта ультрафильтрацией через мембранные фильтры 6) Добавление консерванта 0,5% хлороформа и фасовка по флаконам.

При предварительном исследовании антиоксидантной системы трансгенных растений, активируемой пониженной температурой, показано, что холодовой стресс стимулирует антиоксидантную защиту растений, способствуя накоплению биологически активных соединений и цекропина Р1.

Получены экспериментальные образцы экстрактов трансгенных растений каланхоэ перистого. Показана высокая антибиотическая активность экстрактов трансгенных растений по отношению к фитопатогенным штаммами и штаммам патогенных для человека и животных: Erwinia carotovora, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Показана высокая ранозаживляющая способность экстрактов трансгенных растений на животных по сравнению с экстрактами из нетрансформированных растений.

Результаты исследования устойчивости экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к высокой температуре показали, что экстракты выдерживают кипячение в течение 1 часа.

Исследование устойчивости экспериментальных образцов экстрактов трансгенных растений каланхоэ к длительному хранению методом «ускоренного старения» показали, что полученные экстракты способны храниться в течение 2-х лет не теряя активности.

Исследование эффективности различных консервантов для хранения экстрактов трансгенных растений каланхоэ, что наилучшим из них является хлороформ: при добавлении его к экстракту в концентрации 0,5%, биологические и антибиотические свойства экстракта каланхоэ сохраняются в течение длительного времени.

Изучение факторов деградации цекропина Р1 показало, что использование 0,5% хлороформа и прогревание экстракта при 70°С для инактивации эндогенных протеиназ обеспечивает возможность длительному хранения экстракта (сока) без потери активности антимикробного пептида.

Разработан лабораторный регламент получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого, включающий стадии: 1) Осаждение экстракта трансгенных растений каланхоэ 80%-ным сульфатом аммония; 2) Растворение осадка и диализ; 3) Гельфильтрацию на колонке с сефадексом G-50; 4) Фракционирование полученного элюата на колонке с Superdex Peptide (HR 10/30); 5) Анализ молекулярного веса пептидных фракций методом HPLC; 6) Вестерн-блот анализ с антителами к цекропину Р1.

В процессе наработки экспериментального образца из 15 литров экстракта (из 9 кг листьев) трансгенных растений было получено 7 мг пептида цекропина Р1.

Таким образом, впервые разработан эспериментальный протокол выделения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений.

Практическая значимость исследования
Полученные экстракты трансгенных растений каланхоэ перистого, содержащие антимикробный пептид цекропин Р1, перспективны для создания фармацевтических и зооветеринарных препаратов для лечения ожогов, язв и кожных ран. Трансгенные растения каланхоэ перистого могут быть использованы в медицине как источник субстанции (сока) с повышенной антимикробной активностью. Этот сок пригоден для борьбы с патогенами человека и животных, в том числе: S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, Candida albicans и Proteus vulgaris. Полученные растения каланхоэ перистого представляют собой экономически выгодную альтернативу другим системам экспрессии и могут быть использованы в качестве «биофабрик» по производству цекропина Р1. Трансгенные растения являются единственным на сегодня источником рекомбинантных биогенных антимикробных пептидов, так как в отличие от бактерий, дрожжей и грибов полностью устойчивы к их действию. Разработанные регламенты выделения экстракта и антимикробного пептида цекропина Р1 с помощью современных препаративных методов могут быть использованы на практике при проведении доклинических испытаний нового лекарственного средства на основе сока каланхоэ, содержащего цекропин Р1. По себестоимости они вполне могут конкурировать с химическими методами синтеза цекропина Р1.
Результаты исследования по получению экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого и цекропина Р1 из него, востребованы фармацевтическими компаниями по производству противоожоговых и ранозаживляющих средств, а также в ветеринарной практике.