Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0064

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0064
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное учреждение "Научный центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации"
Название доклада
Разработка ускоренной системы идентификации возбудителей внутрибольничных инфекций с одновременным определением их лекарственной устойчивости на основе ДНК-чипов
Докладчик
Маянский Николай Андреевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на создание быстрого метода обнаружения антибиотикорезистентных микроорганизмов, вызывающих внутрибольничные инфекции (ВБИ). Тенденция неуклонного роста резистентности к имеющимся антибактериальным препаратам особенно ощутима среди грамотрицательных бактерий. Традиционно используемые методы для их обнаружения и выявления резистентности, основанные на микробиологической идентификации, являются трудоемким, продолжительным и достаточно дорогими. Разработка молекулярного метода одновременной идентификации возбудителей ВБИ и определения их устойчивости к антибиотикам позволит в течение не более 24 часов получить результат, на основании которого будет назначаться адекватная антибиотикотерапия. Точная идентификация детерминант устойчивости поможет устанавливать эпидемиологическую связь между возбудителями ВБИ с целью предотвращения их распространения. Таким образом, целью реализуемого проекта является разработка макета тест-системы для идентификации грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей ВБИ с одновременным определением генетических детерминант устойчивости к наиболее эффективным противомикробным препаратам.
Актуальность и новизна исследования
Актуальность создания диагностических тест-систем на основе биочипов следует из решения заседания Рабочей группы по развитию биотехнологий по вопросу создания инновационной медицинской техники под председательством Заместителя Председателя Правительства Российской Федерации А.В. Дворковича (протокол от 5 марта 2013 г. №АД-П12-37пр). В частности, по рассмотренному на этом заседании второму вопросу («II.Об использовании биотехнологий для разработки инновационных медицинских изделий, в том числе современных диагностических средств, включая биосенсоры и биочипы…») было принято соответствующее решение, адресованное Минобрнауки России, Минздраву России совместно с РАН, РАМН, заинтересованными федеральными органам исполнительной власти: «… подготовить предложения по формированию научно-технического задела и содействию формированию исследовательских консорциумов в сфере разработки современных высокотехнологичных диагностических и скрининговых систем, в том числе, на основе биосенсоров и биочипов.». Поэтому объявление темы представляемого лота, оптимальный формат выполнения которой основан на технологии биочипов, ориентировано, в том числе, на выполнение вышеупомянутого решения рабочей группы.
Описание исследования

Проект направлен на разработку метода идентификации грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей внутрибольничных инфекций (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp и др.) с одновременным определением генетических детерминант, определяющих их лекарственную устойчивость к наиболее эффективным противомикробным препаратам, включая карбапенемы, цефалоспорины третьего поколения и препараты пенициллинового ряда. Метод должен быть основан на многопараметрическом анализе последовательностей ДНК исследуемых ВБИ с использованием олигонуклеотидного биочипа.

Для достижения цели должны быть решены следующие задачи:

- на основании анализа литературных данных, включая патентные исследования, должен быть определен оптимальный спектр грамотрицательных микроорганизмов - ВБИ, выбраны генетические мишени, обеспечивающие идентификацию ВБИ с высокими диагностическими характеристиками (чувствительность и специфичность анализа более 90%);

- должен быть определен спектр генов-мишеней, ответственных за устойчивость микроорганизмов к наиболее эффективным антибиотикам, включая карбапенемы, цефалоспорины третьего поколения и препараты пенициллинового ряда;

- должна быть создана коллекция контрольных клинических бактериальных образцов (суммарно не менее 100 ед.), охарактеризованная культуральными и молекулярно-генетическим методами, с подтвержденными генетическими детерминантами устойчивости с использованием мультилокусного секвенирования (MLST). Данная коллекция должна быть использована в качестве контрольной при испытаниях разработанного метода;

- должны быть разработаны (выбраны последовательности, синтезированы, очищены) праймеры для одновременной мультиплексной амплификации выбранных генетических мишеней, а также олигонуклеотидные зонды для иммобилизации на микрочипах, позволяющие идентифицировать продукты амплификации;

- должна быть выполнена оптимизация реакций мультиплексной амплификации с одновременным флуоресцентным маркированием, гибридизации на микрочипе с разработанными олигонуклеотидными зондами;

- должен быть разработан прототип программного обеспечения для автоматизированной регистрации и интерпретации результатов гибридизации на микрочипе;

- должны быть определены оптимальные методы подготовки образцов клинического материала для проведения анализа с использованием клинических образцов;

- должен быть создан макет тест-системы на основе разработанного метода и проведены его лабораторные испытания c использованием образцов из сформированной коллекции, определены диагностические характеристики макета тест-системы;

- в условиях проведения поточных исследований в лабораторном отделе крупного лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ), имеющего опыт работы с возбудителями ВБИ, должна быть изучена популяция штаммов (не менее 500), циркулирующих в стационарных отделениях ЛПУ. Должно быть выполнено сравнение результатов, полученных с использованием разработанного макета тест-системы, и стандартно применяемых в лаборатории методов, проведена их клональная характеристика с помощью MLST;

- полученные результаты должны быть отражены в публикациях и патентной заявке.

Результаты исследования

В ходе выполнения работ по ПНИ были выполнены аналитический обзор современной литературы, затрагивающей научно-техническую проблему идентификации и антибиотикорезистентности возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ), и патентные исследования. Определен спектр генетических мишеней для идентификации возбудителей ВБИ и их устойчивости к антибиотикам. Был разработан комплект специальных реагентов (СР), обеспечивающих идентификацию возбудителей ВБИ и молекулярных детерминант устойчивости к антибиотикам. Для создания прототипа диагностического микрочипа разработанные олигонуклеотидные зонды (набор СР) были синтезированы и очищены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Был синтезирован набор праймеров для амплификации участков генов-мишеней устойчивости к антибиотикам. Был произведен синтез праймеров для проведения ПЦР с целью характеристики коллекции образцов ДНК. Был разработан комплект реагентов для амплификации (АМ), обеспечивающий амплификацию и флуоресцентное маркирование целевых фрагментов генома с целью идентификации возбудителей ВБИ и молекулярных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам. Проведена экспериментальная проверка олигонуклеотидов и праймеров АМ. Составлена спецификация на комплект АМ. Проведена иммобилизации олигонуклеотидов из числа молекулярных зондов специальных реагентов (СР) на подложках и изготовлены экспериментальные серии ДНК-чипов (всего 720 единиц). Проведены испытания СР в соответствии с Программой и методиками испытаний, достигнуты целевые значения чувствительности, специфичности, воспроизводимости. Был разработан комплект реагентов для гибридизации (ГБ), обеспечивающий гибридизацию флуоресцентно меченых фрагментов, полученных с использованием комплекта АМ, на биочипах с иммобилизованными молекулярными зондами. Был изготовлен контрольный образец (КО). Был разработан набор контрольных образцов (НКО), предназначенный для выборочной проверки партий готовой продукции (Тест-системы) в производственном цикле. Была проведена модификация пользовательского блок-шаблона, поставляемого в комплекте с программным обеспечением «ImaGeWare». Описаны технические требования и предложения по разработке и производству Тест-системы. Была создана коллекция образцов ДНК возбудителей ВБИ, всего депонировано 411 образцов ДНК. Были проведены работы по созданию и поддержанию коллекции микроорганизмов, полученных из биологического материала, для контроля аналитических характеристик макета тест-системы; коллекция содержит 524 изолята возбудителей ВБИ. В ходе разработки комплекта ГБ были оптимизированы состав и концентрация компонентов буфера для гибридизации, а также температура и время гибридизации. Разработанный КО представляет собой синтетическую ДНК длиной 24 нуклеотида и обеспечивает контроль за корректным выполнением ключевых стадий анализа амплификации и гибридизации. Разработанный пользовательский блок-шаблон позволяет управлять программным обеспечением «ImaGeWare», которое, в свою очередь, определяет команды, подаваемые на анализатор биочипов. Коллекция микроорганизмов, полученных из биологического материала, для контроля аналитических характеристик макета тест-системы содержит 524 изолята возбудителей ВБИ, видовой состав которых полностью удовлетворяет требованиям ТЗ. 

Практическая значимость исследования
Разработанная тест-система будет адаптирована для использования в лабораториях любого уровня, имеющих необходимые навыки в проведении стандартной ПЦР. Подразумевается, что наиболее эффективно метод должен использоваться в клинических лабораториях при ЛПУ, в которых проблема борьбы с ВБИ является особенно актуальной. Практическое внедрение научно-технических результатов будет осуществляться в лабораториях лечебно-профилактических учреждений, включая стационары крупных больниц и научно-исследовательских институтов, вне зависимости от ведомственной принадлежности, а также родильных домов. Полученные результаты окажут влияние на развитие отечественной запатентованной технологии ДНК-микрочипов, будут способствовать улучшению потребительских свойств существующей продукции с учетом географического распространения возбудителей ВБИ и практических требований лабораторий ЛПУ. Разработанная тест-система может стать удобным инструментом при проведении эпидемиологических исследований ВБИ как в конкретном ЛПУ, так и в масштабе РФ. Осуществление проекта позволит усовершенствовать технологические процессы на предприятии Индустриального партнера с точки зрения снижения издержек производства, повышения производственной безопасности, включая экологическую, повышения уровня автоматизации производства, обеспечения его гибкости, сокращение времени производственного цикла без потери качества.