Регистрация / Вход
Прислать материал

14.613.21.0057

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.613.21.0057
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»
Название доклада
Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, предназначенных для создания тест-систем для серодиагностики гепатита Е.
Докладчик
Алаторцева Галина Ивановна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
- Получение рекомбинантных аналогов антигенов вируса гепатита Е (ВГЕ) серотипов, циркулирующих на территории стран СНГ.
- Проведение сероэпидемиологического мониторинга по острым вирусным гепатитам в регионах Российской Федерации и СНГ, определение доли гепатита Е (ГЕ) в этиологической структуре вирусных гепатитов в регионах Российской Федерации и СНГ.
- Создание банков биологических и клинических образцов от больных гепатитами и здоровых людей и животных.
Актуальность и новизна исследования
Основу профилактики ГЕ составляют мероприятия по организации системы эпидемиологического надзора, включающие регистрацию, учет, эпидемиологическое расследование каждого случая и анализ заболеваемости. Их осуществление невозможно без разработки диагностических тестов для определения серологических маркеров ВГЕ. К настоящему времени достигнут значительный прогресс в области изучения антигенного состава белков ВГЕ и создания высокоэффективных рекомбинантных антигенов для применения в лабораторной диагностике. Однако не решено много важных вопросов, касающихся чувствительности и специфичности имеющихся диагностических тестов. Сложность антигенного состава, генетическая неоднородность и различия в эпидемиологии ГЕ в различных географических регионах мира требуют совершенствования методов серодиагностики. Разработка рекомбинантных аналогов антигенов ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, циркулирующих на территории СНГ, значительно облегчит задачу создания и совершенствования тест-систем для серодиагностики ГЕ и проведения эпидемиологических исследований на постсоветском пространстве.
Новизна выбранного способа решения поставленной задачи заключается в использовании клинического материала от инфицированных ВГЕ людей и животных из регионов СНГ для клонирования фрагментов вирусного генома.
Разработка рекомбинантных антигенов вируса на основе изолятов, полученных на территориях стран СНГ, не имеет мировых аналогов, поэтому результат исследований, а именно, разработка рекомбинантных антигенов ВГЕ для создания диагностических тест-систем, должен быть охраноспособным.
Описание исследования

В работе были использованы коммерческие препараты ферментов, солей и других реактивов, коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления антител IgG и IgM к возбудителям вирусных гепатитов (А, В, С, Е).

Серологические методы. Метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), метод Вестерн-блоттинга.

Молекулярно-биологические методы. РНК ВГЕ в клинических образцах определяли методом ОТ-ПЦР с вырожденными праймерами к участку генома ВГЕ, кодирующему капсидный белок. Выделение нуклеиновых кислот из образцов сывороток крови и фекальных экстрактов проводили с помощью коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителей. Качество выделенной РНК оценивали с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием TagMan-проб. Синтез праймеров и проб для проведения ПЦР выполнен в Центре коллективного пользования ФГБУН «ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Нуклеотидные последовательности анализируемых фрагментов вирусных геномов определяли прямым секвенированием ПЦР-продуктов, размер которых соответствовал величине фрагмента-мишени. Секвенирование каждого ПЦР-фрагмента выполняли в двух направлениях – с прямым и обратным праймерами. ДНК-копию вирусной РНК получали с помощью обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы SuperScript III RT (компания Invitrogen) и олиго-dT-праймеров. Фрагменты генома ВГЕ 1-го генотипа, содержащие открытые рамки считывания 2 и 3 (orf2 и orf3), клонировали медом ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Phusion и ДНК-праймеров, фланкирующих выбранный участок генома вируса. Полученные ПЦР-продукты обрабатывали Taq ДНК-полимеразой, очищали на колонках фирмы Qiagen и вставляли в вектор pALT-2 (Евроген, Россия) с помощью A/T-клонирования в клетках Е. coli CC001 (XL Blue, Евроген, Россия). Нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента верифицировали с помощью секвенирования. Полученные плазмиды использовали в качестве матричных ДНК в экспериментах по субклонированию диагностически значимых фрагментов orf2 и orf3 вирусного генома в эспрессирующей системе E.coli. С этой целью были сконструированы специфические праймеры. Искомые фрагменты ДНК амплифицировали с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Phusion и клонировали по соответствующим сайтам рестрикции в вектор pЕL5с с последующей трансформацией клеток E. coli PLT90, селекцией клонов на устойчивость к ампициллину, выделением плазмидной ДНК и определением нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента. с помощью Белковый состав лизатов E.coli и препаратов рекомбинантных белков анализировали методами электрофореза в денатурирующих условиях и Вестерн- блоттинга.

Биотехнологические и биохимические методы. Биомассу отобранных штаммов-продуцентов клеток E. coli выращивали в биореакторе в условиях термоиндукции синтеза рекомбинантного белка. Рекомбинантные антигены очищали методом гель-фильтрации на колонках TSK HW-55. Процесс получения биомасс и выделения из них рекомбинантных белков контролировали путем постадийного отбора проб и последующего их анализа методами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и иммуноблоттинга со специфическими сыворотками.

Биоинформационные методы. Специфичность амплификации и генотип вируса определяли с помощью пакета программ анализа нуклеотидных и полипептидных последовательностей «Vector NTI» (версия 10) и функции BLAST в базе данных NCBI. Нуклеотидные последовательности фрагментов вирусных геномов при генотипировании клинических и биологических образцов анализировали с помощью программы MEGA (версии 4.0 и 4.1), сравнивая с доступными на момент проведения исследования данными в международных базах данных нуклеотидных последовательностей.

Результаты исследования

Проведен анализ заболеваемости ГЕ в период с января 2013 по июнь 2016 гг. Выявлены регионы РФ с ежегодно регистрируемой спорадической заболеваемостью. В Белгородской области показана сезонная динамика инфекции, рост заболеваемости в осенний период. Обследованы образцы от здоровых лиц и пациентов с острым гепатитом, в том числе от трудовых мигрантов из Узбекистана, Таджикистана, Украины и Молдовы. Антитела IgG и IgM чаще выявлялись среди мигрантов из Узбекистана и Таджикистана по сравнению с мигрантами из Украины и Молдовы, что отражает степень эндемичности регионов их происхождения. В образцах фекалий от IgM-положительных лиц не выявлена РНК ВГЕ, что может свидетельствовать о недостаточной специфичности использованных серологических тестов. Высокая частота выявления антител IgM у трудовых мигрантов не исключает вероятность завоза ГЕ в РФ.

Создан банк образцов сывороток крови и фекалий здоровых и больных вирусными гепатитами людей и животных из регионов РФ, БР и КР, типированных в коммерческих ИФА- и ПЦР-тест-системах.

На основе биоинформационного анализа рассчитаны специфические праймеры для клонирования фрагментов бицистронной субгеномной РНК ВГЕ 1-го генотипа. На матрице РНК ВГЕ, выделенной от больного из КР, получили ДНК-копию с использованием олиго-dT-праймеров. С помощью синтезированных праймеров провели ПЦР-амплификацию с последующим А/Т клонированием. В итоге были получены клоны E.coli CCOO1 (XL-Blue), содержащие в составе рекомбинантной плазмиды фрагменты ДНК размером 2,3 т.п.н., соответствующие субгеномной РНК вируса, что подтверждено секвенированием. Эти фрагменты ДНК использовали для получения рекомбинантных штаммов E.coli, синтезирующих антигены ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го генотипа в виде слитных с β-галактозидазой полипептидов, содержащих N-концевой фрагмент белка ORF2 и полноразмерную копию белка ORF3. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного белка ORF3 в бактериальной системе проведена оптимизация кодонов клонированного фрагмента. По результатам анализа белкового состава лизатов рекомбинантных клонов E.coli методами электрофореза и иммуноблоттинга выбраны штаммы-продуценты с максимальным синтезом целевого продукта. Отработаны условия культивирования рекомбинантных штаммов для получения биомасс и методика очистки рекомбинантных антигенов. Антигенная специфичность полученных полипептидов подтверждена в ИФА и Вестерн-блоттинге со специфическими сыворотками.

Работы, выполненные иностранными партнерами за счет внебюджетных средств:

НПО «Профилактическая медицина» МЗ КР: анализ эпидемиологической ситуации по ГЕ в регионах КР, сбор и типирование методами ПЦР и ИФА образцов фекалий и сывороток крови от здоровых лиц и больных вирусными гепатитами.

РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» РБ: анализ эпидемиологической и эпизоотической ситуации по заболеваниям печени в республике, получение кроличьих поликлональных антител к рекомбинантным антигенам ВГЕ, синтез пероксидазных конъюгатов на их основе, разработка иммуноферментной тест-системы для выявления IgG-антител к ВГЕ у свиней, создание банка биообразцов от здоровых и больных с печеночной патологией людей и животных.

Достигнутые результаты имеют приоритетное значение: впервые в мировой практике получены рекомбинантные антигены ВГЕ на основе клинического материала, отобранного на территории СНГ; впервые получены данные по многолетней динамике заболеваемости ГЕ в России.

Практическая значимость исследования
Достигнутые результаты обеспечивают теоретическую, методическую и научно-практическую базу для продолжения прикладных научных исследований на следующих этапах. Получение рекомбинантных аналогов антигенов ВГЕ 1-го генотипа, циркулирующего на территории СНГ, значительно облегчит задачу создания новых тест-систем в форматах ИФА и иммуноблоттинга с улучшенными характеристиками качества, безопасности, аналитической и диагностической эффективности для серодиагностики ГЕ и проведения эпидемиологических и эпизоотических исследований на территории стран СНГ.
Создание банков клинических образцов из эндемичных и неэндемичных регионов СНГ позволит изучать антигенные свойства разрабатываемых рекомбинантных белков при разработке и апробации диагностических тест-систем.
Создание новых конкурентоспособных тест-систем с улучшенной диагностической эффективностью позволит:
- изучать эпидемиологию ГЕ, развитие иммунитета при ГЕ, эффективность вакцинации;
- своевременно организовать проведение противоэпидемических мероприятий в очагах;
- осуществлять раннюю адекватную терапию и сократить потери от нетрудоспособности;
- повысить эффективность мероприятий по охране материнства и детства в районах с высокой заболеваемостью
Важным эффектом для здравоохранения явится решение вопроса об истинной интенсивности эпидпроцесса в странах СНГ, оценка которой в данный момент затруднена из-за отсутствия исследований удельного веса ВГЕ-инфекции в этиологической структуре вирусных гепатитов. Внедрение новых, более чувствительных и специфичных диагностических тестов будет способствовать развитию знаний об эпидемиологии ГЕ и формированию объективной оценки заболеваемости. В частности, полученные данные об отсутствии подтверждения текущей ВГЕ-инфекции выявлением вирусной РНК у IgM-положительных лиц ставит вопрос о специфичности выявления антител IgM. Дальнейший анализ таких образцов с использованием разрабатываемых рекомбинантных пептидов вероятно позволит решить этот вопрос.
Значимым экономическим эффектом станет снижение себестоимости диагностических наборов за счет импортозамещения: цена зарубежных аналогов составляет от 1 до 2 тыс. долларов США за 1 мг, прогнозируемая себестоимость 1 мг разрабатываемых антигенов - 100-200 долларов.
Постер

Poster_NIIVS 2016.ppt