Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0136

Аннотация скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0136
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Разработка лабораторного регламента и набора реагентов для пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий человека методом высокопроизводительного секвенирования
Докладчик
Тетруашвили Нана Картлосовна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Создание отечественного набора реагентов и методики его использования в клинической практике для выполнения первой стадии неинвазивного пренатального молекулярного скрининга анеуплоидий человека - приготовления библиотек ДНК для последующего полупроводникового высокопроизводительного секвенирования - и разработка программного обеспечения для анализа данных секвенирования.
Актуальность и новизна исследования
В структуре причин репродуктивных потерь, неонатальной смертности и детской инвалидности одно из ведущих мест занимают хромосомные анеуплоидии (ХА). Они обуславливают не менее 30 % спорадических неразвивающихся беременностей и выкидышей, а у новорожденных встречаются с частотой до 1:300. Одними из самых частых анеуплоидий, приводящих к рождению ребенка с пороками и задержкой развития, являются трисомии по 21, 18 и 13 хромосомам(1:650-1000, 1:6000-8000 и 1:10000-16000 соответственно ). Риск возникновения таких хромосомных нарушений у плода существенно увеличивается с возрастом матери.
В настоящее время при массовом биохимическом скрининге на ХА во II триместре беременности, который осуществляется в соответствии с Приказом Минздрава России от 28.12.2000 г. № 457, в группу риска попадает много женщин, вынашивающих здоровый плод. Так, после проведения скрининга на сроке 15-17 недель трисомия по 21-й хромосоме с помощью инвазивных методов подтверждается лишь примерно у 1 из 80 беременных. Это приводит к снижению доверия к результатам скрининга и к значительному количеству отказов от инвазивной диагностики. В частности, от инвазивной диагностики отказываются около половины женщин, вынашивающих плод с трисомией по 21-й хромосоме. Комбинированный скрининг I триместра согласно (Постановлению Правительства Российской Федерации № 1159 от 31.12.2009 г) даже при четком соблюдении сроков позволяет отнести в группу риска лишь около 80 % беременностей плодами с трисомией по 21-й хромосоме.
Наиболее перспективным является неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг, основанный на анализе внеклеточной ДНК плода в крови матери. Его широкому внедрению препятствует дороговизна метода.
Описание исследования

1. Сформировать группы беременных женщин с низкой и высокой степенью риска по реализации хромосомной патологии для отбора биологического материала в коллекцию для валидации предполагаемого к разработке набора реагентов, программного обеспечения и метода. Отбор женщин в группы будет производитель на основе анамнеза и результатов лабораторных исследований.
2. Разработать набор реагентов для получения ДНК-библиотек для последующего высокопроизводительного секвенирования тотальной внеклеточной свободноциркулирующей ДНК из плазмы крови беременных женщин и программное обеспечение для контроля качества приготовления ДНК-библиотек и анализа данных секвенирования. В основу будет положен перспективный метод прямого подсчёта числа прочтений для каждой хромосомы. Набор будет включать реагенты для оценки доли фетальной внеклеточной ДНК в образце биологического материала, что является уникальной технической характеристикой в настоящий момент.
3. Провести валидацию разработанного метода на основании кариотипирования при проведении инвазивных процедур у женщин высокого риска хромосомной патологии плода, а также на основании кариотипирования родившихся детей (или абортусов).

Результаты исследования

Начат сбор сукболлекции биологического материала, выполняющийся Соисполнителем (ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.И.Городкова" Минздрава России). Основной задачей является отработка сбора и траснопортировки образцов с использованием специальных консервантов, исключающих необходимость замораживания образца. На стадии создания пилотной коллекции определены потенциально проблемные моменты (например, перемораживание образцов, собирающихся со специальными консервантами, в ходе транспортировки в холодное время года), а также способы их фиксации (фотографирования партии образцов при приёмке на основной базе) и возможности предотвращения (использование изотермных контейнеров большей изолирующей способности при экстремальных температурах окружающей среды, следовательно, в протоколе транспортировки должна быть отражена необходимость мониторинга погодных условий). На основании этих результатов подготовлен протокол транспортировки образцов.биологического материала.

Набрана коллекция в составе 377 образцов от женщин высокого риска, 214 - низкого. Соисполнителем доставлено 10 образцов от женщин высокого риска с подтверждёнными анеуплоидиями плода, 112 образцов от женщин низкого риска.

Индустриальным партнёром выбраны составные части реагентов для оценки доли фетальной ДНК в исследуемых образцах. Использован подход определения доли фДНК по специфичным для плода полиморфным генетическим локусам. Геном человека содержит значительное количество полиморфных локусов, в том числе с высокой степень внутрипопуляционного полиморфизма (вплоть до теоретически максимальных 50% представленности аллелей). Способы детекции генетических полиморфизмов хорошо отлажены и доступны в рутинной клинической практике. Кроме того, методическая основа ДНК-скрининга — высокопроизводительное секвенирования — принципиально направлено, в том числе,именно на одномоментный анализ широкого спектра полиморфных генетических локусов. Таким образом, определение доли фДНК возможно непосредственно в ходе выполнения ключевой технологической операции ДНК-скрининга и может быть реализовано как дополнительный алгоритм программного анализа исходных данных NGS («сырых данных» — от англ. «raw data»).

Разработаны и изготовлены макеты набора реагентов с программным обеспечением и документацией на макет и ПО. Разработаны проект лабораторного регламента проведения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий человека с помощью разработанного набора реагентов и программного обеспечения и протокол транспортировки образцов биологического материала.

Практическая значимость исследования
Применение разработанных набора реагентов, программного обеспечения и лабораторного регламента позволит значительно расширить область применения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий в российском здравоохранении. Тем самым удастся повысить эффективность выявления анеуплоидий (в том числе трисомии по 21 хромосоме, приводящий к синдрому Дауна) на ранних сроках беременности, а также снизить частоту ятрогенных осложнений (включая потери беременности).