Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0103

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0103
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Название доклада
Поиск белковых и гликановых онкомаркеров и их сигнатур в сыворотках крови больных онкологическими заболеваниями, с целью выявления новых диагностических маркеров колоректального рака.
Докладчик
Рубина Алла Юрьевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1) Основной задачей проекта является выявление наиболее эффективных сигнатур онкоассоциированных серологических маркеров для ранней диагностики колоректального рака.
2) Основной целью выполнения работ является:
- Выявить маркеры и их диагностически значимые комбинации (сигнатуры), включающие естественные антитела и гликопротеины для диагностики колоректального рака.
- Разработать макет тест-системы на основе сигнатур и оценить его диагностическую чувствительность и специфичность.
Актуальность и новизна исследования
Несмотря на большое разнообразие молекулярных подходов к скринингу колоректального рака (КРР), в настоящее время все еще существует необходимость в методе, обладающим высоким диагностическим потенциалом для повышения эффективности скрининга/диагностики КРР.
В настоящее время, для диагностики КРР, определяют концентрацию двух онкомаркеров: карциноэмбрионального антигена (РЭА) и карбогидратного антигена CA 19-9 в сыворотке крови пациента методом иммуноферментного анализа. Этот метод имеет низкую специфичность и чувствительность.
Исследования, проведенные в ИМБ РАН продемонстрировали, что выявление антител к гликановым структурам совместно с определением онкомаркеров белковой природы при КРР имеет высокую клиническую значимость и открывает новые возможности диагностического сопровождения процесса онкотерапии [Butvilovskaya V.I. Multiplex determination of serological signatures in the sera of colorectal cancer patients using hydrogel biochips.2016.Cancer medicine, p.1-12]. Это связано с тем, что антитела к гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака.
Разрабатываемый в рамках выполнения ПНИ макет тест-системы на основе биочипа позволяет в одном анализе определять профиль не менее шести белковых онкомаркеров, в том числе АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB 4, CA 242 и гликановую сигнатуру. Для определения гликановой сигнатуры в ячейках биочипа иммобилизованы 47 онкоассоциированных гликанов, включая: SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc. При выполнении ПНИ обнаружены сигнатуры, позволяющие выявлять колоректальный рак на ранней стадии надежнее, чем обычно используемая пара онкомаркеров CEA и CA19.9.

Описание исследования

Изготовление биочипов с иммобилизованными молекулярными зондами: антителами против различных классов человеческих иммуноглобулинов, антителами против онкомаркеров, онкоассоциированными гликанами  изготавливали по методу сополимеризационной иммобилизации, разработанному в ИМБ РАН. Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида, а также подлежащие иммобилизации зонды, наносили с помощью робота QArray («Genetix», Великобритания) в виде микрокапель объемом 0,1 нл на поверхность активированного Bind Silane стеклянного слайда Corning, США (Corning 2947 Micro Slides). Полимеризацию гелевых ячеек проводили при UV облучении (354 нм). После завершения полимеризации биочипы отмывали в течение 40 минут PBST, промывали дистиллированной водой, и высушивали. Получали 3D гелевые элементы полусферической формы диаметром 120 мкм. Ячейки помимо спейсерированных гликанов (47 шт. http://www.lectinity.ru/Россия, Москва) содержали иммобилизованные вторичные поликлональные антитела goat anti-human IgM (Fc5µ), вторичные поликлональные антитела goat anti-human IgA (alpha), вторичные поликлональные антитела goat anti-human gamma chain, вторичные поликлональные антитела goat anti-human IgA+ IgM (H+L)+IgG (Pierce, США); антитела против онкомаркеров:  РЭА, СА 19-9, СА 15-3, СА 125, ПСА, ХГЧ, АФП, СА 242  (Fujirebio diagnostics,  США) и SCCA1, SCCA2 (МГУ, ИМБ РАН). Для уменьшения неспецифических взаимодействий чипы обрабатывали блокирующим буфером PBSP (1% раствор PVA в PBS) в течение 1 ч, затем промывали дистиллированной водой и высушивали. Качество полученных чипов проверяли в проходящем свете с помощью биочип-анализатора, снабженного  программным обеспечением TestChip и QualityСontrol (В результате проверки качества отбраковывали чипы, для которых отклонения значений радиусов гелевых элементов превышали 5% внутри каждого чипа и 8% между всеми чипами данной партии).
Процедура проведения иммуноанализа на биочипах: В работе использовали следующие буферы: PBS (0.01M фосфатный буфер, pH 7.2, 0,15M NaCl), отмывочный буфер PBST (PBS, содержащий 0.01% Tween-20), буфер для разведений (DB) при постановке иммуноанализа: 0.15%-ные растворы PVA и PVP в PBS. Все буферные растворы были приготовлены с использованием деионизованной воды MilliQ.
На биочипы наносили по 120 мкл раствора сыворотки крови. Инкубацию проводили в течение 24 ч при 37оС. После кратковременной (20 мин) отмывки в PBST, микрочипы проявляли конъюгатом соответствующих вторичных биотинилированных антител (0,01 мг/мл, 60 мин, при 37оС). После отмывки в PBST (20 мин, при 24°C) инкубировали с раствором конъюгата стрептавидина с флуоресцентным красителем (15 мин, 37°С, 0,005 мг/мл). После отмывки PBST (30 мин, при 24°C) приступали к регистрации флуоресцентных сигналов. 
Регистрация флуоресцентных сигналов: Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный сканер, (Genepix 4200 A (Molecular Devices, США)). Величины флуоресцентных сигналов рассчитывали с помощью программного обеспечения Genepix Pro 6.0 (Molecular Devices, США). Для интерпретации результатов использовали интенсивность флуоресценции F635 median, полученную в программе Genepix Pro 6.0. 

Статистический анализ получаемых данных: Для оценки прогностической способности тест-систем, в доказательной медицине значительное распространение получил метод анализа ROC-кривых. Этот метод позволяет сравнить эффективность выявления патологического состояния организма при использовании различных альтернативных диагностических систем.
ROC-кривые представляют собою графики зависимости истинно положительных (TP) от ложноположительных решений (FP), получаемых наблюдателем при оценке результатов исследования.Сравнительный анализ диагностической эффективности разных факторов при мультиплексном анализе на чипах  проводился с помощью многопараметрического лог-регрессионного анализа  и ROC-кривых (Receive Operating Characteristic curve analysis). Чем больше площадь под  ROC-кривой, тем выше диагностическая эффективность данного фактора. Метод определения диагноза считается превосходным, если площадь под ROC-кривой  AUC=0.9–1.0; очень хорошим при AUC=0.8-0.9; хорошим при AUC=0.7–0.8; удовлетворительным при AUC=0.6–0.7; и неудовлетворительным при AUC=0.5–0.6. Случайное предсказание соответствует AUC=0.5. Статистическая обработка данных анализов (концентрация онкомаркеров, флуоресцентные сигналы от PGA, полученные после проведения иммуноанализа на чипах) проводилась с помощью программ MedCalc Version 11.4.2.0 and Statistica Version 8.0.  

 

 

Результаты исследования

Современная in-vitro диагностика КРР основана на анализе кала на скрытую кровь, иммунохимическом определении гемоглобина в стуле пациента, иммуноферментном определении онкомаркеров белковой природы РЭА и СА 19-9. Эти методы не обладают высокой специфичностью и чувствительностью.
 Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов in-vitro диагносткик КРР являются их миниатюризация, повышение чувствительностии и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа молекуляных маркеров и их комбинаций (сигнатур) в сыворотке крови пациента. В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов. Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов.  Важно то, что только технология 3D биочипов, разработанная в ИМБ РАН, уникальна и позволяет в одном диагностикуме использовать элементы с иммобилизованными антителами к онкомаркерам, антителами к иммуноглобулинам человека и иммобилизованными гликанами. Структура гидрогеля позволяет иммобилизовать молекулярные зонды с большей плотностью в пересчете на единицу поверхности по сравнению с 2D биочипами, полностью сохраняя при этом их биологическую активность, что особенно важно для белков, которые подвержены денатурации. Высокое и контролируемое качество биочипов при производстве, контроль диаметра ячеек, позволяет получать высоко воспроизводимые результаты иммунофлуоресцентного анализа, что, несомненно, подтверждает высокий технологический уровень заявленного исследования.
Клиническая диагностика колоректального рака с использованием разрабатываемой тест- системы основана на определении диагностически значимых комбинаций маркеров (сигнатур), включающих  естественные антитела и гликопротеины в сыворотке крови пациента. Разрабатываемая тест- система включает в себя биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела к онкомаркерам и онкоассоциированные гликаны, а так же набор реагентов для проведения иммунофлуоресцентного анализа на биологическом микрочипе.
Биологические микрочипы (биочипы), позволяющие проводить одновременный анализ наличия антител к онкоассоциированным гликанам и определять концентрацию онкомаркеров  в микрообъеме биологического образца, производятся по оригинальной российской технологии гидрогелевых биочипов, разработанной в ИМБ РАН (http://www.biochip-imb.ru). Обнаружены сигнатуры, состоящие из онкомаркеров (АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB 4, CA 242) и антител к гликанам (SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc, 3`- SiaLeC,  LeC3LeC, LeCα6LN, P1, 3-LacNAc-Tn, LeY, 6-SiaβTF), позволяющие надежно диагностировать КРР (AUC=0,9, чувствительность 88%, специфичность 98%, диагностическая эффективность 95%).
Полученные результаты сопоставимы по значимости с результатами мировых исследований в области диагностики колоректального рака (OriCol  Кембридж, Англия). 

 

 

 

Практическая значимость исследования
По окончании выполнения проекта будут обнаружены новые эффективные серологические маркеры, в том числе онкоассоциированные гликаны и их комбинации (сигнатуры) для раннего обнаружения колоректального рака, создан задел для дальнейшего перехода к производству диагностической тест-системы "КР- БИОЧИП". Разрабатываемая тест-система будет обнаруживать колоректальный рак на ранних стадиях по определению профилей белковых онкомаркеров (не менее шести, в том числе АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB4, CА 242) и гликановой сигнатуры (не менее 20-ти онкоассоциированных гликанов, включая: SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc) в одном микрообъеме сыворотки/плазмы крови на микрочипе. Тест-система должна обеспечивать: чувствительность: 90%, не менее; специфичность: 80%, не менее; общее время выполнения анализа – 20 часов, не более; объем сыворотки/плазмы крови человека, достаточный для проведения одного анализа 100 мкл.
Наиболее часто КРР наблюдают в возрасте 40-60 лет. Однако рак может возникать и в более молодом возрасте (20-30 лет).
Например, в 2013 г. на поздних стадиях (III, IV) выявлены 48,3% случаев раковых заболеваний прямой кишки.Несмотря на рост диагностических возможностей, оснащенности медицинских учреждений высокоэффективным диагностическим оборудованием, доля больных, заболевание у которых выявлено на ранней стадии опухолевого процесса, остается низкой. На 100 новых больных КРР приходится более 70 умерших, из них около 40% на первом году с момента установления диагноза. Метастатическая стадия КРР является крайне актуальной медико-экономической проблемой.
На этом фоне социально-экономический эффект РИД, связанный с возможностью диагностировать рак на I-II стадии, вызывает особый интерес. В РОНЦ Блохина показано, что стоимость диагностики КРР составляет 16 757 руб., медицинских услуг – 379 815 руб., терапии МКРР в качестве первой линии режимом XELOX - 1 172 731 руб. на одного пациента.
Число больных колоректальным раком на 2015г. в России не менее 187 200 человек, применение тест-системы, разрабатываемой в рамках ПНИ, позволит диагностировать КРР на I-II стадии, тем самым позволяя экономить только на лечении одного пациента не менее 500 000 руб. Таким образом, социально- экономический эффект составит не менее 93 млрд. руб.