Регистрация / Вход
Прислать материал

14.575.21.0036

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.575.21.0036
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"
Название доклада
Разработка генетического контроля экзоцитоза
Докладчик
Касымов Виталий Анварович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта: создание методик на основе функциональных и/или генетических конструкций для контроля экзоцитоза в астроцитах головного мозга крысы.
Проект направлен на: (i) исследование функциональных взаимодействий астроглиальных клеток и нейронов в различных регионах головного мозга, в норме и при патологиях; (ii) определение клеток-источников нейротрансмиттеров и сигнальных молекул, принимающих участие в регуляции количества их выброса, в различных участках головного мозга; (iii) создание новых инструментов для точного контроля клеточных функций in vitro и in vivo через активацию или ингибирование внутриклеточных сигнальных путей, с использованием опто- и хемогенетических подходов (модифицированные свето- или хемочувствительные ионные каналы, протонные помпы, альфа и бета адренорецепторы, G-белок связывающие рецепторы q-типа, активируемых специфическими препаратами); и (iv) разработку новых подходов для точного контроля функций головного мозга через генетическую модификацию и регуляцию целевых клеточных популяций. В целом, исследование направлено на разработку новых терапевтических стратегий, направленных на компенсацию утраченных функций головного мозга.
Актуальность и новизна исследования
В рамках данного проекта разрабатывается система контроля везикулярного транспорта астроцитов для возможного ее применения в коррекции нейродегенеративных заболеваний. Для понимания роли сигнализации между астроцитами, а также между астроцитами и нейронами в функционировании мозга, решающее значение имеет изучение астроцитов in situ, при котором сложная морфология астроцитов и их тесная связь с нейронами остается неизменными. Понимание взаимодействий между нейронами и глией in vivo требует специальных экспериментальных подходов для манипулирования каждым типом клеток независимо, и это представляет собой нетривиальную задачу. Использование генетических конструкций являются новейшим инструментом для управления клеточными процессами и функциями, позволяющим активировать либо ингибировать определенные внутриклеточные сигнальные каскады как in vitro так и in vivo на бодрствующих животных. В рамках настоящего проекта использованы современные новейшие методы синтетической биологии, направленные на создание функциональных генетических конструкций, обеспечивающих системное изменение фенотипа клеток. Эти подходы включают в себя целевой трансгенез и вирусную трансдукцию для гиперэкспрессии или блокирования экспрессии специфического гена в астроцитах.
Описание исследования

Одной из основных задач нейробиологии является выяснение механизмов, лежащих в основе передачи информации с одной клетки на другую. В настоящее время всеобщее признание получила везикулярная гипотеза освобождения сигнальных молекул, по которой передача информации от одной клетки мозга к другой происходит за счет химического агента - нейро- или глиотрансмиттера, который концентрируется в везикулах и выделяется из них посредством везикулярного транспорта - экзоцитоза. Везикулярный транспорт трасмиттеров является одним из основных механизмов межклеточных коммуникаций и трансдукции сигнала в головном мозге. В основе нейродегенеративных процессов, включая боковой амиотрофический склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона лежит аксональная патология, которая в большинстве случаев опосредуется изменениями трансмиттерного профиля. На сегодняшний день мы имеем ограниченные знания механизмов патогенеза неврологических и метаболических болезней головного мозга, что негативно сказывается на темпах разработок новых методов лечения заболеваний ЦНС. Качественно-количественный дисбаланс нейро- и глиотрансмиттеров оказывает негативное влияние на межнейрональную коммуникацию. Участниками патогенеза всегда являются нейроны и клетки глии, в частности, астроциты. Согласно последним данным, астроциты принимают непосредственное участие в поддержании трансмиттероного и метаболического баланса, необходимого для нормального функционирования нейронов. Таким образом, разработка методик контроля везикулярного транспорта в астроцитах является перспективным направлением для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний. В рамках настоящего проекта использованы современные новейшие методы синтетической биологии, направленные на создание функциональных генетических конструкций, обеспечивающих системное изменение фенотипа клеток. Эти подходы включают в себя целевой трансгенез и вирусную трансдукцию для гиперэкспрессии или блокирования экспрессии специфического гена в астроцитах.

Описание методик:

Иммуногистохимический анализ уровня экспрессии глиотрансмиттеров и глиомодуляторов, ферментов и везикулярных транспортеров клеток астроглии с последующей визуализацией на сканирующем конфокальном микроскопе. Иммуногистохимический анализ представляет собой быстрый и высокорепрезентативный метод качественной и количественной оценки трансмиттерного и рецепторного профиля клеток. В комплексе со сканирующей конфокальной микроскопией и программным обеспечением обработки изображений иммуногистохимический анализ является неотъемлемым компонентом современных нейробиологических исследований.

Выделение астроцитов из разных областей коры посредством метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). FACS представляет собой эффективный метод выделения как живых, так и фиксированных клеток определённого типа из клеточной суспензии. Сортировка астроцитов будет производиться на клеточном сортере S3e (BioRad, США) с использованием астроцит-специфичных антител, меченных флуорофором. Использование клеточного сортера S3e (БФУ им. И. Канта) – это максимально автоматизированный и прецизионный метод выделения клеток.

Транскриптомный анализ астроцитов крысы с целью оценки их экспрессионного профиля. Транскриптомный анализ, в частности секвенирование - это набор инструментов и подходов для широкомасштабного анализа экспрессии генов, что позволит оценить и сравнить уровни экспрессии определённых генов в астроцитах из разных зон коры головного мозга. Транскриптомный анализ производится с использованием системы полногеномного секвенирования MiSeq (Illumina, США).

Создание и применение генетических конструкций для трансфекции астроцитов с целью исследования изменений в α- и β-адренергических, пуринергических и G-белок зависимых сигнальных путях in vitro и in vivo. Использование генетических конструкций нашло широкое применение в нейробиологии за счёт возможности непосредственного и строго селективного влияния на сигнальные пути клетки, что позволяет, в частности, проведение оценки изменений профиля глиотрансмиттеров в астроцитах in vitro и in vivo  в норме и при трансфекции генетическими конструкциями посредством использования кальциевых индикаторов и сканирующей конфокальной микроскопии на LSM 780 (Zeiss, Германия). Использование кальциевых индикаторов является уникальной неинвазивной технологией регистрации клеточной активности и позволяет регистрировать изменения концентрации внутриклеточного кальция в реальном времени.

Результаты исследования

Научно-технический уровень выполняемых ПНИ соответствует лучшим достижениям в данной области. Поставленные задачи выполнения прикладных научных исследований в целом решены полностью. Полученные в ходе реализации проекта культуры клеток астроглии характеризуются высоким процентом выживаемости и чистоты культуры. Генетические конструкции, разработанные для специфической трансфекции клеток астроглии отличаются высоким и стабильным уровнем трансфекции и экспрессии репортерного белка. Метод вирусной доставки генов в клетки мозга является передовой технологией разрабатываемой и применяемой в передовых научно-исследовательских центрах мира и имеет большой потенциал в терапии многих нейрогенеративных заболеваний. Все требования, указанные в техническом задании, а именно: - основные требования к выполнению ПНИ (Требования к составу научно-технических результатов ПНИ), - технические требования (Требования по назначению научно-технических результатов), - требования к документации - требования к патентным исследованиям и регистрации результатов интеллектуальной деятельности, выполнены и соблюдены в полном объеме. Научно-технический уровень выполняемых ПНИ соответствует лучшим достижениям в данной области. 

В ходе выполнения ПНИ получены следующие научно-технические результаты:

1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.

2 Отчеты о патентных исследованиях.

3 Лабораторный протокол создания генетической конструкции на основе вирусных векторов.

4 Лабораторный протокол создания моделей культуры клеток астроглии головного мозга крыс.

5 Программа и методики испытаний набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии в культуре клеток in vitro.

6 Лабораторный протокол трансфекции астроглии in vivo.

7 Программа и методики испытаний экспериментальных образцов набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов in vivo.

8 Экспериментальные образцы набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.

9 Лабораторный протокол создания набора реагентов для трансфекции астроглии на основе вирусных векторов.

10 Проект инструкции по применению набора реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов.

11 Рекомендации по коммерциализации результатов ПНИ, а также по использованию в дальнейших исследованиях и разработках.

Научно-технические результаты соответствуют следующим техническим требованиям:

Разрабатываемые генетические конструкции и набор реагентов для специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов должны предназначаться для исследования и терапии нейродегенеративных заболеваний.

1. Основа генетической конструкции (вирусная) – ленти- и/или аденоассоциированный вирусный вектор.

2. Количество маркерных белков –2, не менее.

3. Специфичность к определенному типу клеток – 97%, не менее.

4. Возбуждение сигнальных каскадов – химически и/или оптически.

5. Количество индуцируемых сигнальных каскадов – 3, не менее.

6. Токсичность – для применения in vivo (не токсично).

7. Тип трансфецируемых клеток – дифференцированные.

Практическая значимость исследования
Результаты, полученные в рамках заявляемого проекта, в дальнейшем будут использованы для создания нового типа генной терапии заболеваний, вызывающих деградацию нейронов. Особенностью данной технологии, основанной на вирусной трансфекции клеток, является возможность ее не инвазивного применения. При этом оптимальным является применение хемогенетического контроля экспрессии, используя который можно добиться специфичности экспрессии инкорпорированных генов в определенных зонах головного мозга. Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего» и национальной инициативы "Нейротехнологии": нейробиологии, клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней.