Регистрация / Вход
Прислать материал

14.578.21.0051

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.578.21.0051
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"
Название доклада
Бифункциональный рекомбинантный агент белковой природы на основе фрагмента псевдомонадного экзотоксина А для таргетной терапии HER2-положительных опухолей
Докладчик
Деев Сергей Михайлович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Практическими целями данного Проекта являются: (1) разработка и получение нового вида научно-технической импортозамещающей продукции с терапевтическим потенциалом, а именно, адресного бифункционального агента белковой природы «анти-HER2-токсин», предназначенного для селективной элиминации опухолевых клеток с повышенной экспрессией онкомаркера HER2; (2) оценка функциональной активности и терапевтического потенциала полученного адресного бифункционального агента «анти-HER2-токсин». Объектами настоящего исследования являются бифункциональные рекомбинантные белки на основе фрагмента псевдомонадного экзотоксина А и направляющего модуля, специфичного к онкомаркеру HER2. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:
- получение четырех вариантов анти-HER2-токсина, различающихся природой направляющего модуля и способом экспрессии в клетках бактериального продуцента;
- исследование физико-химических, иммунохимических и функциональных свойств полученных вариантов in vitro;
- исследование терапевтического потенциала оптимального по совокупности свойств варианта анти-HER2-токсина in vivo;
- разработка Лабораторного регламента получения анти-HER2-токсина и подготовка Проекта технического задания на проведение НИОКР по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе адресного бифункционального агента «анти-HER2токсин», предназначенного для селективной элиминации опухолевых клеток с гиперэкспрессией онкомаркера HER2».
Актуальность и новизна исследования
Разработка новых подходов к терапии онкологических заболеваний – одна из наиболее актуальных и активно развивающихся областей биологии и медицины. Ведущим трендом в этой области является персонализированный подход, основанный на выборе оптимального метода лечения с учетом молекулярно-генетических особенностей опухоли в каждом конкретном случае. Благодаря прогрессу в изучении молекулярных основ канцерогенеза, в последние десятилетия все бóльшую роль в рамках персонализированного подхода начинает играть таргетная (направленная) терапия. Этот подход основан на использовании адресных бифункциональных агентов, способных избирательно связываться с маркером-мишенью на поверхности опухолевых клеток (функция направленной доставки) и вызывать их гибель (терапевтическая функция). К таким агентам, в частности, относятся импортные препараты, специфичные к онкмаркеру HER2 и активно используемые для лечения рака молочной железы – Herceptin®, Perjeta®, Kadcyla®. Несмотря на некоторые побочные эффекты и дороговизну, наблюдается ежегодный рост продаж этих агентов как за рубежом, так и в России, в то время как отечественные аналоги отсутствуют. Это свидетельствует об актуальности, социальной и экономической значимости задач, связанных с таргетной терапией HER2-положительных опухолей. В рамках Проекта в России впервые будет разработан аналогичный упомянутым препарат для таргетной терапии HER2-положительных типов рака.



Описание исследования

Исследование направлено на разработку и внедрение нового адресного бифункционального агента белковой природы «анти-HER2-токсин», предназначенного для селективной элиминации опухолевых клеток с повышенной экспрессией онкомаркера HER2.

В рамках реализации Проекта впервые в России использован перспективный подход для создания адресных противоопухолевых бифункциональных агентов на основе новых рекомбинантных направляющих белковых модулей, специфичных к онкомаркеру HER2 и обеспечивающих избирательное действие агента на опухолевые клетки с экспрессией данного онкомаркера. В качестве таких направляющих модулей использованы: 1) одноцепочечное антитело 4D5scFv, представляющие собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела, лежащего в основе широко применяемого в медицинской практике импортного противоопухолевого препарата Herceptin; 2) инновационный искусственно полученный каркасный полипептид – дарпин D29. В качестве альтернативы антителам, традиционно используемым в качестве нацеливающих молекул, дарпины обладают рядом преимуществ: небольшим размером белка, что облегчает биохимические манипуляции с ним; отсутствием в структуре остатков цистеина и, как следствие, устойчивостью к агрегации и хорошей экспрессией; термодинамической стабильностью.

В качестве токсического модуля использован фрагмент псевдомонадного экзотоксина А (PE40) – одного из самых высокотоксичных белковых токсинов, известных на сегодняшний день, на основе которого создан целый ряд иммунотоксинов, специфичных к различным мишеням. Два функциональных модуля в целевом агенте объединены в единый рекомбинантный белок методами генной инженерии. Генно-инженерный подход к получению бифункционального полипептида обладает рядом преимуществ в сравнении с часто используемой для этих целей химической конъюгацией, в первую очередь, постоянством состава и функциональных характеристик, что особенно важно для целей данного Проекта. Бифункциональные анти-HER2-токсины получены в бактериальных продуцентах, что обеспечивает легкое масштабирование технологии в лабораторном и промышленном производстве. Помимо природы направляющего модуля (4D5scFv или D29), варианты разрабатываемого агента различаются также способом экспрессии в клетках продуцентов E. coli: цитоплазматическая (варианты 4D5scFv-PE40 и D29-PE40) и периплазматическая экспрессия, призванная снизить токсический эффект действия белка на клетку-продуцент и повысить уровень растворимой фракции целевого белка (варианты 4D5scFv-PE40/p и D29-PE40/p). Таким образом, изначально предложено четыре варианта бифункционального рекомбинантного агента «анти-HER2-токсин». Для исследований физико-химических, иммунохимических и функциональных свойств вариантов разрабатываемого агента in vitro разработаны соответствующие методики, предполагающие использование современных методов биофизики, молекулярной и клеточной биологии, обеспечивающих воспроизводимые и достоверные результаты: денатурирующий гель-электрофорез, иммуноблотинг, спектрофотометрия, иммуноферментный анализ, метод поверхностного плазмонного резонанса, метод культуры клеток. По совокупности исследованных свойств in vitro (эффективности экспрессии и очистки целевого рекомбинантного белка, физико-химическим и иммунохимическим характеристикам, функциональной активности) выбран оптимальный вариант анти-HER2-токсина – рекомбинантный белок D29-PE40 с цитоплазматической экспрессией. В отношении выбранного варианта проведена оценка терапевтического потенциала in vivo с использованием ксенографтных моделей HER2-гиперэкспрессирующей опухоли человека, полученных на иммунодефицитных животных. Подобный подход широко используется в экспериментальной онкологии и представляется оптимальным для оценки эффективности таргетных препаратов, специфичных к молекулярным мишеням человека.

Результаты исследования

В результате реализации Проекта получены значимые научные результаты по разработке и внедрению адресного бифункционального агента белковой природы «анти-HER2-токсин». Разработанный агент снабжен соответствующей научно-технической документацией и подготовлен для прохождения стадии доклинических испытаний. В результате технико-экономической оценки рыночного потенциала полученных результатов даны рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках. Анти-HER2-токсин является аналогом импортных HER2-специфичных препаратов трастузумаб (Herceptin®) и трастузумаб-эмтанзин (Kadcyla®). Однако в отличие от трастузумаба анти-HER2-токсин рассматривается как более эффективный, поскольку содержит в своем составе мощный токсический модуль на основе бактериального экзотоксина, а в отличие от трастузумаб-эмтанзина является более биотехнологичным (а значит, более дешевым соединением), поскольку представляет собой рекомбинантный белок постоянного состава, не требующий посттрансляционных химических модификаций.

В ходе выполнения Проекта получены следующие основные результаты:

- получены четыре независимых экспериментальных образца анти-HER2-токсина (образцы №1-4);

- разработаны и валидированы методики контроля качества анти-HER2-токсина;

- в соответствии с разработанной Программой и методиками исследовательских испытаний установлено, что образцы №1-4 являются независимыми вариантами анти-HER2-токсина со структурой, соответствующей запланированной; при соблюдении условий хранения стабильны в течение 3-х месяцев; специфично взаимодействуют с онкомаркером HER2;

 - показано высокоаффинное связывание образцов анти-HER2-токсина с онкомаркером HER2 (в соответствии с разработанной Методикой) со значениями равновесной константы диссоциации в наномолярном диапазоне концентраций;

- показана высокоселективная цитотоксичность образцов анти-HER2-токсина (в соответствии с разработанной Методикой) для клеток, гиперэкспрессирующих HER2, в области низких пикомолярных концентраций;

- выявлен выраженный терапевтический потенциал оптимального образца анти-HER2-токсина со значением коэффициента торможения роста опухоли более 60% по сравнению с контролем (в соответствии с адаптированной методикой), продемонстрировано влияние анти-HER2-токсина на гисто-морфологические характеристики опухоли;

- разработаны Лабораторный регламент получения анти-HER2-токсина и Проект технического задания на проведение НИОКР по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе адресного бифункционального агента «анти-HER2токсин», предназначенного для селективной элиминации опухолевых клеток с гиперэкспрессией онкомаркера HER2».

По итогам выполнения Проекта оформлено 2 патентные заявки и опубликовано 6 статей в рецензируемых научных журналах. Полученные результаты полностью соответствуют условиям Технического Задания и Плана-графика Проекта. Уровень научно-технического выполнения задач соответствует мировому.

Практическая значимость исследования
Области применения полученных результатов: здравоохранение, фармацевтическая промышленность, наука и образование. Бифункциональный рекомбинантный белок «анти-HER2-токсин», полученный в результате выполнения Проекта, будет являться продуктом новой технологии в области биоинженерии и будет представлять собой потенциальный противоопухолевый терапевтический агент для таргетной терапии опухолей с гиперэкспрессией онкомаркера HER2. Разработанные в ходе выполнения Проекта методики получения и количественной оценки функциональных свойств «анти-HER2-токсина» могут быть использованы при создании и исследовании подобных бифункциональных агентов, в том числе полученных на основе других направляющего и токсического модулей (то есть, с другой специфичностью и механизмом действия). Возможными потребителями научно-технических результатов Проекта могут стать организации реального сектора экономики, специализирующиеся на разработке и внедрении фармацевтических субстанций для создания противоопухолевых лекарственных средств. После успешного выполнения Проекта необходимо выполнение полноформатных доклинических исследований, весь объем которых может быть реализован на базе сертифицированной по принципам GMP лаборатории биологических испытаний Филиала Института биоорганической химии РАН. При получении положительных результатов последующие клинические испытания могут быть выполнены на базе ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России и/или ФГБУ Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН.
Результаты выполненных исследований будут включены в циклы лекций профессора С.М. Деева по новейшим методам биоинженерии в МГУ им. М.В. Ломоносова и ННГУ им. Н.И. Лобачевского.