Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0093

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0093
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов
Докладчик
Летаров Андрей Викторович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы является разработка концепции, описывающей влияние корпускулярной структуры антигена на его иммуногенность. Решение этой задачи способно повысить иммуногенность вакцинных субстанций в 100-500 раз, пропорционально сократив её расход при изготовлении коммерческих вакцин.
В задачи исследования входило:
1. На примере протективного антигена Bacillus anthracis разработать подход по модификации антигенов, которые могут быть использованы для повышения эффективности иммунобиологических препаратов вакцинного назначения.
2. Создать прототип иммунобиологического препарата на основе протективного антигена B. anthracis с генно-инженерными модификациями (слияние со структурными белками бактериофагов), которые позволяют формировать вирусоподобные частицы и за счет этого направленно регулировать силу и специфичность иммунного ответа.
3. Изучить иммуногенность полученного антигена и оценить возможность его применения для конструирования вакцин.
Актуальность и новизна исследования
Во всем мире производство вакцин отстает по показателям рентабельности от других продуктов на фармацевтическом рынке. Поэтому себестоимость вакцинных субстанций существенно влияет на доступный потребителю ассортимент производимых вакцин. Особенно это касается вакцин ветеринарного назначения. В настоящем обзоре проведен анализ опубликованных данных о существующих вакцинах, который позволяет сделать вывод о более высокой иммуногенности субстанций на основе цельных вирусных частиц по сравнению с растворимыми антигенами. Высказывается предположение, что именно этот фактор, физиологическая основа которого остается неизвестной, не позволил внедрить в практику описанные в литературе многочисленные варианты рекомбинантных вакцин. На практике все применяемые противовирусные вакцины кроме вакцин против вируса гепатита B основаны на использовании вирусных частиц, получаемых классическими культуральными методами. С учётом этого наблюдения выдвигаются подходы к созданию универсальной платформы для производства рекомбинантных вакцин в форме вирусоподобных частиц. Для этого в рамках проекта была использована технология получения слитых бифункциональных производных на основе структурных белков бактериофагов, несущих целевые антигены. Подход исследуется на примере традиционного вакцинного антигена - протективного антигена возбудителя сибирской язвы.
Описание исследования

В настоящее время происходит интенсивная замена вакцин, основанных на живых аттенюированных штаммах вирусов и бактерий субъединичными вакцинами на основе рекомбинантных белков, которые обеспечивают формирование достаточного протективного иммунного ответа при значительном уменьшении риска побочных реакций. Однако, во многих случаях рекомбинантные белки в виде растворов или иммобилизованные на различных химических носителях обладают недостаточной иммуногенностью. Повышение иммуногенности за счет формирования вирусоподобных частиц, нагруженных целевым антигеном позволит достичь развития достаточного протективного ответа при использовании рекомбинантных антигенов, а также обеспечит экономию дорогостоящей субстанции, что приведет к удешевлению вакцинного препарата. Для формирования вирусоподобных частиц нами будут протестированы два различных подхода: использование рекомбинантных фаговых частиц (либо фагов помощников в сочетании с рекомбинантным штаммом хозяина) и использование трансляционного слияния со структурными белками бактериофагов, обладающими способностью к полимеризации.

Использование рекомбинантных белков в качестве основы для вакцин имеет целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными. Для первых характерен высокий уровень биологической безопасности, так как в процессе изготовления не используются, а в самой готовой субстанции рекомбинантного белка не содержатся патогенные бактерии, вирусы или продукты их жизнедеятельности. Кроме того, рекомбинантные технологии позволяют применять для конструирования вакцин отдельные антигены и даже их фрагменты, что обеспечивает высокую специфичность ответа. Однако до настоящего времени на рынке практически отсутствуют вакцины на основе рекомбинантных белков. Единственным значимым исключением является вакцина против вирусного гепатита В.

В случае противовирусных вакцин основной причиной такого положения является тот факт, что субъединичные вакцины на основе растворимых антигенов уступают по иммуногенности цельновирионным, что приводит к необходимости использования более высоких доз рекомбинантных антигенов по сравнению с природными. Причина повышенной иммуногенности антигена, имеющего наноразмерную корпускулярную структуру, остается неизвестной.

 

Результаты исследования

Исследована возможность самосборки вирусоподобных частиц из созданного слитого белка «антиген протективного антигена B. anthracis - белок бактериофага. Для этой цели использовался белок трубки хвоста бактериофага DT57C, родственного фагу Т5. Получен достаточный выход вирусоподобных частиц. Методами белковой химии и электронной микроскопии подтвержден факт образования регулярных агрегатов белка

Отработаны условия предварительной бесколоночной очистки вирусоподобных частиц и окончательной очистки с помощью гель-фильтрации.

Получен иммунобиологический препарат на основе вирусоподобных частиц, содержащий протективный антиген B. anthracis и оформлен лабораторный регламент его получения.

Наработаны экспериментальные образцы иммунобиологических препаратов на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.

Проведены работы по патентованию результатов исследований и разработок.

Исследованы технологически важные характеристики экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц: физико-химические свойства, гомогенность, стойкость при хранении.

Доказана высокая стабильность и гомогенность ВПЧ, сформированных белком – продуктом конструкции pTTPPA. Методом динамического светорассеяния показано, что их размер составляет около 48 нм, который практически не меняется при хранении в течение 1-4 месяцев.

Разработан план исследований иммуногенности экспериментального образца иммунобиологического препарата in vitro и in vivo.

Проведена иммунизация мышей экспериментальным образцом иммунобиологического препарата.

Выполнены исследования иммуногенности экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vitro, в том числе, в реакции бласт-трансформации лейкоцитов с оценкой результата с помощью ПЦР в реальном времени.

В тестах in vitro с применением методов оценки скорости бласт-трансформации смешанной культуры лейкоцитов показано, что иммунизация мышей протективным антигеном в форме ВПЧ приводит к существенно более интенсивному образованию Т-лимфоцитов специфичных к протективному антигену B. anthracis, чем иммунизация растворимым протективным антигеном в очищенном виде или в форме коммерчески доступной живой вакцины. Бласт-трансформация В-лимфоцитов в СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в форме ВПЧ, также идет интенсивнее, чем в случае СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в растворимой форме.

Выполнены исследования экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vivo по уровню продукции токсин-нейтрализующих антител.

Показано, что уровень продукции токсин-нейтрализующих антител при иммунизации животных экспериментальным образцом - протективным антигеном B. anthracis в форме ВПЧ в среднем в два раза выше, чем при иммунизации протективным антигеном в растворимой форме.

Практическая значимость исследования
В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать стойкий иммунитет у привитых животных. Помимо этого, для снижения себестоимости производства, предотвращения риска заражения людей и животных производственными штаммами желательно использовать полностью безопасные микроорганизмы, трансформация которых генетическими конструкциями, несущими гены ключевых антигенов B. anthracis, позволит получить высокоэффективную субъединичную рекомбинантную вакцину против сибирской язвы для сельскохозяйственных животных.
Основным типом потребителя разработки представляются крупные и средние биофабрики, обладающие опытом производства и испытания вакцин против особо опасных инфекций и дистрибьюторской сетью. Примерами таких предприятий могут служить ФКП «Щёлковский биокомбинат» и ФКП «Орловская биофабрика».
В случае удачного решения поставленной задачи по снижению себестоимости дозы вакцины в 5-7 раз по сравнению с существующими аналогами и снижению розничной цены дозы в 3 раза объём выпуска продукции по новой технологии может оказаться сопоставим с объёмом потребления наиболее массовых ветеринарных вакцин, то есть, достигнуть 40 млн. доз в год при общей стоимости 4-6 млрд. руб.