Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0003

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0003
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"
Название доклада
Разработка научных основ применения рентгеновских лазеров на свободных электронах для биологических исследований
Докладчик
Фатеева Татьяна Владимировна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1. разработка набора тестовых объектов для отработки принципиальных вопросов использования РЛСЭ для изучения структуры и динамики биологических объектов, удовлетворяющих условию иерархичности: макромолекулы – надмолекулярные структуры (как некристаллические, так и нанокристаллы) – клеточная органелла 2. определение набора предварительных характеристик для тестовых объектов, необходимых для интерпретации данных экспериментов на РЛСЭ 3. разработка методов и методик инструментальных подходов для определения предварительных характеристик структурно-кинетической (структурно-динамической) организации тестовых объектов 4. разработка методов и методик для подготовки объектов к измерениям на РЛСЭ 5. проведение экспериментов по проверке качества отбора тестовых объектов, методов и методик подготовки объектов, инструментальных подходов для определения предварительных характеристик объектов, информативности набора предварительных характеристик объектов для проведения измерений на РЛСЭ. 6. разработка и адаптация методов вычисления характеристических векторов для дифракционных изображений макромолекулярных объектов и их применение для задач автоматической классификации, кластеризации, фильтрации экспериментальных данных
Актуальность и новизна исследования
Уровень развития современной биологии, биомедицины, фармакологии требует знаний о механизмах биологических процессов в норме и патологии с атомной точностью. В настоящее время в базах данных содержится информация только о порядка 90 тысяч из миллионов белковых структур. К сожалению, огромное число белковых структур, особенно сложных белковых комплексов, практически не поддаются кристаллизации или получаемые для них кристаллы имеют нанометровые размеры и сильные дефекты, что осложняет использование классического РСА. Использование рентгеновских лазеров на свободных электронах (РЛСЭ) дает принципиально новые возможности как для структурного анализа биологических объектов, так и изучения их функциональной структурной динамики. Сочетание огромной яркости вспышки свыше 1023 вт/см2 (сфокусированную на область 100 нм2) и короткой длительности порядка 10 фс приводит к совершенно уникальным возможностям этого инструмента. Синхронизируя вспышки рентгеновского лазера и впрыск бимакромолекул или их комплексов в пучок с определенной задержкой после перевода макромолекул в функционально активное состояние возможно, в принципе, получить для функционального акта т.н. «молекулярное кино». Вместе с тем, при использовании рентгеновского лазера для изучения структуры и динамики весьма нежных биологических объектов различного уровня организации возникает целый ряд новых и нерешенных проблем. Это касается самых различных аспектов – от пробоподготовки, подачи объекта в камеру и удержания объекта в поле лазера до обработки данных рассеяния.
Описание исследования

Исследование включает в себя несколько этапов. На первом и втором этапе проводились преимущественно теоретические исследования, посвященные выбору объектов исследований объектов, методов проведения экспериментов, платформ, аппаратных средств, средств разработки программ, способов представления данных. Широко использован метод биоинформатического анализа для оценки эскпрессируемости и стабильности исследуемых белков, их фрагментов, а также предсказания и сравнения их структурных особенностей. 

На начальном этапе работы были также  разработаны методы преобразования дифракционных изображений отдельных макромолекул в характеристический вектор и принципы манипулирования и удержания микро- и нано частиц с применением лазеров. Использование методов молекулярного моделирования позволяет получать важную информацию на всех этапах реконструкции структуры с помощью РЛЭ. Для определения структуры белкового комплекса можно построить начальную молекулярную модель, используя моделирование по гомологии. Несмотря на то, что белковые последовательности содержат ценную информацию о функциях, часто функционально значимые остатки невозможно определить в силу высокой пластичности последовательностей [8].Перед исследователем в области анализа сигнала при использовании XFEL стоит задача восстановления трехмерного распределения электронной плотности по множеству дифракционных изображений, полученных от отдельных молекул или нанокристаллов. При решении этой задачи необходимо сделать два принципиальных шага: выполнить обратное преобразование Фурье (при этом решить сопряженную с ним фазовую проблему), и перейти от двумерных представлений к трехмерным. Эти шаги могут быть выполнены в различном порядке. Для решения фазовой проблемы существуют известные алгоритмы, однако они нуждаются в оптимизации и дальнейшей разработке – в первую очередь для повышения их скорости. Один из путей оптимизация состоит в интеграции данных рентгеновского рассеяния с данными, полученными другими методами, для получения информации о низких пространственных частотах и выбора начального приближения

В качестве наиболее перспективных биологических объектов и белковых комплексов для исследований с помощью ЛСЭ могут быть названы мембранные белки, рибосомы, протеосомы, комплексы с нуклеосомами и другие. С точки зрения структурных измерений несомненный интерес для отработки методов представляет линейка иерархически усложняющихся объектов, представляющих собой светочувствительные белки (родопсины) варьируемой структуры, надмолекулярные образования этих белков типа нанодисков и нанокристаллов, клеточные органеллы, содержащие тот же тип белков (зрительные диски). С точки зрения разработки техники удержания объектов в поле луча лазера представляет интерес, что разные типы этих белков имеют сильно разный дипольный момент, достигающий у сенсорного родопсина значений порядка 60 тыс.дебай. Дополнительно значимым фактором работы со светочувствительными белками является возможность проведения с ними кинетических измерений, возбуждаемых фемтосекундным оптическим лазером. На основании аналитического обзора современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей различные аспекты исследования структуры белка, для проведения дальнейших работ по выделению, очистке и были отобраны следующие объекты: GPCR - CysLT1, каталитическая субъединица теломеразы O. Рolymorpha (TERT), бактериородопсин Halobacterium salinarum, N- и C-концевые домены белка CTCF, ZAD-домены белков CG6654, Serendipity-d, Pita и Zw5, BTB-домен белка CP190, гистоноподобные ДНК-связывающие HU-белки. ​Для исследования мембранных белков необходимо получать их в растворимой форме. При растворении большинства мембранных белков нативная конформация становится нестабильной, так как замена липидов биологической мембраны на ПАВ или детергент искажает структуру белка. Иной подход состоит в переносе белка в липидный слой после экстракции из биомембран. Например, в качестве носителя для белка можно использовать бицеллы или нанодиски. Получение и характеристика липид-белковых нанодисков стало важным этапом настоящей работы.

Широко были использованы в данной работе генно-инженерные методы получения химерных белков (каталитической субъединицы (TERT) теломеразы O. polymorpha, архитектурных белков D. Melanogaster и их структурных доменов и т.п.) и ДНК. Для последующего анализа, выделения и очистки целевого продукта применялись электрофорез по Лэммли, вестерн-блоттинг, методы афинной и гель-хроматографии.

 

Результаты исследования

На начальном этапе работы был теоретически обоснован выбор нано дисков и липодисков, содержащих комплексы сенсорного родопсина с трансдюсерным белком, и методов их получения. Проведена оптимизация получения ЛБН для бесклеточной продукции мембранных белков. Проведен сравнительно-биоиформатический анализ ретиналь-содержащих белков. Исследованы подходы к получению бактериородопсина H. salinarum в составе липид-детергентных систем, белок  экспрессирован и очищен в  количествах, необходимых для проведения кристаллизационых тестов. Оптимизированы процедуры выделения, очистки и ренатурации рекомбинантного белка в липид-детергентных системах для кристаллизационных тестов, проведены  тестовые кристаллизационные эксперименты. Получены ЛБН, содержащие родопсин в препаративных количествах. Оптимизирован протокол ко-трансляционной инкапсуляции ESR в ЛБН в бесклеточных белоксинтезируемых системах. Охарактеризрованы физико-химических свойства природных фоторецепторных нанодисков и полученных препаратов ESR/ЛБН.   

С помощью биоинформатического анализа охарактеризованы фрагменты, соответствующих структурным доменам TERT O. Рolymorpha других организмов. Выбраны фрагменты последовательности TERT для клонирования, по результатам отобраны белки, экспрессируемые в растворимой форме. Разработан метод ко-экспрессии в E.coli компонентов теломеразного комплекса. Подтверждена теломеразная активность полученных наночастиц.

Клонированы,  экспрессированы и выделены 10 архитектурных белков D. Melanogaster и их структурных доменов, участвующих в формировании инсуляторных комплексов.  Ряд  белков получен в количествах, необходимых для работ по кристаллизации и функциональных исследований.  Белков  и/или их структурных доменов функционально охарактеризованы. 

Наработаны препаративные количества HU-белков паразитических микроорганизмов для целей кристаллизации. Исследована ДНК связывающая способность Hu-белков и стабильность образующихся ДНК-белковых комплексов. Подобраны условия кристаллизации очищенных HU-белков.

Получена серия генно-инженерных конструкций с мембранным белком CysLT1. Проведены тестовые экспрессии генноинженерных конструкций CysLT1 в клетках насекомых,  Получены экспериментальные образцы  ВТВ-домена СР190 и N-к и С-к доменов CTCF.

Разработан протокол моделирования отобранных макромолекулярных и надмолекулярных объектов,  экспериментальные схемы манипулятора микро- и нано частиц с применением лазеров.  Разработаны методы моделирования тестовых карт электронной плотности от макромолекулярных и надмолекулярных объектов, способы манипулирования микро- и нано частиц с применением лазеров. Разработан алгоритм кластеризации характеристических векторов для модельных данных по дифракции отдельных макромолекул Расcчитаны динамические траектории отобранных молекулярных объектов. Проведены сборка и тестирование экспериментальной схемы манипуятора микро и нано-частиц  с  применением лазера. Исследована связь пространственной структуры макромолекул и различных элементов дифракционной картины. Оптимизирован метод кластеризации изображения.

Развит метод классификации в части поиска пространственных особенностей молекул. Исследованы зависимости точности алгоритма от геометрии системы, определение практических требований для возможности нахождения корректного решения, влияние деформации системы частиц на изменения дифракционной картины.   

Практическая значимость исследования
Полученные в ходе выполнения проекта результаты могут найти применение в научных биомедицинских центрах и производственных компаниях, работающих в области биоинженерии, а также создания новых функциональных материалов, использующих принципы организации живой материи. Применение разработанных в проекте рентгеновских методов исследованиях биоорганических наносистем в условиях, приближенных к физиологическим, обеспечивает качественно новый уровень информативности медико-биологических исследований, так как понимание молекулярных
Внедрение результатов данного этапа проекта, как ожидаются, от создания принципиально новой научной и приборной базы, предназначенной для постановки в Российской Федерации приоритетных исследований по нанодиагностике биологических объектов в условиях, приближенных к естественным условиям их функционирования. Разработка экспериментальных и теоретических методов исследований выбранных объектов позволит увеличить число реализуемых на станции European XFEL исследовательских методик и расширить круг решаемых задач