Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0044

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0044
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Структура и функции калиевых потенциалзависимых каналов и их мутантных форм, ответственных за развитие хронических сердечных и неврологических заболеваний
Докладчик
Соколова Ольга Сергеевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Изучение влияния мутаций на структуру и функции ионных каналов Kv7 и Kv10 при патологиях сердца и нервной системы и поиск потенциальных лигандов для терапевтических целей. Разработка методов фиттинга кристаллических структур в электронную плотность, полученную с помощью электронного микроскопа для поиска низкомолекулярных терапевтических лигандов, нормализирующих деятельность человеческих потенциал-зависимых каналов.
Актуальность и новизна исследования
Объем мирового рынка медицинских изделий и препаратов против сердечной аритмии, оценивается в 2 млрд долларов в год с прогнозом увеличения до 3 млрд долларов в 2020г. При этом объем мирового рынка мониторинга последствий сердечной аритмии составляет 2 биллиона долларов в год.
Изучение структурных и функциональных свойств калиевых потенциал-зависимых каналов позволит понять механизмы, приводящие к нарушению их функционирования. Понимание этих механизмов, в свою очередь, приведет к созданию научно-обоснованных методов направленной коррекции активности каналов для нормализации их функции.
Известно, что каналы Kv7 вовлечены в возникновение ряда наследственных заболеваний. Кроме того, эти каналы являются мишенью для создания болеутоляющих средств и перспективной мишенью для агентов, нормализующих функционирование гладкой мускулатуры. Особая привлекательность терапевтического воздействия на каналы Kv7 состоит в том, что разные изоформы демонстрируют специфическую экспрессию в тканях, что позволит обеспечить лечебный эффект при минимальном побочном действии. Вместе с тем, в настоящее время применение в медицинской практике нашли лишь несколько препаратов, действующих на каналы Kv7. Понимание структурно-функциональной связи в этих каналах позволит с новой стороны подойти к модулированию функции каналов с помощью лекарственных средств.
Изучение структуры каналов Kv10 и их биологической роли только начинается, но уже показано, что ряд мутаций в этих каналах может привести к тяжелым дегенеративным заболеваниям. Можно полагать, что детали структурной организации каналов Kv10, полученные в данной работе, позволят определить возможность терапевтического воздействия в лечении подобных заболеваний.
Описание исследования

Разработана система экспрессии и очистки функциональных белков человеческих ионных каналов дикого типа и с мутациями в эукариотических клетках. В канале Kv7 были выбраны для анализа две мутации: аминокислотная замена S140G, приводящая к сдвигу в сторону негативных потенциалов и R539W, приводящая к сдвигу в сторону позитивных потенциалов и приводящая к нарушению модулирования канала полярными липидами. В канале Kv10 были выбраны для анализа две мутации, находящиеся в области S4-S5 линкера (G348R) и ворот канала (I467V). Эти аминокислотные замены повышают функцию каналов.

Мутантные каналы получены методом ПЦР и одноцепочечных синтетических олигонуклеотидов (праймеров), несущих необходимую нуклеотидную замену.

Каналы проанализированы методом петч-кламп в лаборатории иностранного партнера, Ж.Лоссарна.

Структура функциональных ионных каналов Kv10 изучена с помощью электронной микроскопии. Для этого отдельные изображения молекул собирают и классифицируют с использованием современных программ для анализа изображений. Качество классов оценивают с помощью Фурье-преобразования. Лучшие классы, демонстрирующие наиболее четкие структурные характеристики, отбираюты для построения первичной реконструкции частицы. Полученная трехмерная модель используется далее в качестве референсной для получения структуры с более высоким разрешением.

Атомная структура отдельных доменов каналов (мембранного, цитоплазматических) была получена в результате моделирования по гомологии с  кристаллической структурой подобных доменов других каналов (Kv1.2, MlotiK, HCN, Kv10.1). Для идентификации шаблонов был использован сервер SWISS-MODEL.  Аминокислотные последовательности выровнены с помощью программы T-COFFEE. Построение моделей на основе выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей проводилось в программе MODELLER. 

Результаты исследования

Проведен подбор условий для экспрессии и очистки белков потенциалзависимых калиевых каналов дикого типа. Выбраны оптимальные условия для экспрессии канала Kv10.2 дикого типа в эукариотической клеточной линии COS-1.

Определена локализация и время экспонирования белков канала в мембрану клеток. Подобраны условия для очистки и выделения канала Kv10.2 с использованием аффинной хроматографии. Частицы каналов хорошо видны при окраске солями урана и исследовании в просвечивающем электронном микроскопе.

Подобраны условия для введения мутаций в белки калиевых каналов. Иностранный партнер провел серию электрофизиологических экспериментов для подтверждения функциональности изучаемых каналов.

Разработаны новые методы моделирования функциональной динамики потенциалзависимых ионных каналов; 

1)Методом тяжёло-атомной и крупно-зернистой молекулярной динамики исследовались модельные липидные бислои, в которые впоследствии были вставлены модели ионных каналов. Показано, что увеличение количества липидов ДПФИ приводит к уменьшению площади и объёма на липид, а также коэффициента латеральной диффузии липидов ДПФХ.

2)С помощью разработанных методов улучшена ранее полученная пространственная модель канала Kv10.2. Для этого произведено моделирование порового домена, образованного спиралями S5-P-S6 и петлевыми участками между ними. Расчет молекулярной динамики полученной модели подтвердил ее стабильность.

Организована и проведена школа для молодых ученых по структуре и функциям ионных каналов на базе МГУ им. М.В.Ломоносова с участием иностранного партнера.
 

Практическая значимость исследования
Ближайшие последствия реализации проекта – формулировка рекомендаций для дальнейшей ОКР для проведения доклинических испытаний выбранных низкомолекулярных соединений. Долгосрочные последствия реализации проекта – внедрение новых препаратов в широкую медицинскую практику и использование их для лечения хронических сердечных и неврологических заболеваний, в том числе с применением контролируемой доставки.
Постер

Poster_MSU (1).pptx