Регистрация / Вход
Прислать материал

14.579.21.0021

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.579.21.0021
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Общество с ограниченной ответственностью "БИОРЕАКТОР"
Название доклада
Создание полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ и технологии его производства
Докладчик
Машенцева Наталья Геннадьевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель работы: разработка биопрепарата на основе пробиотического штамма молочнокислого микроорганизма, синтезирующего L-лизин в организме сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы, и создание технологии его производства.
Задачи:
1. Аналитический обзор информационных источников, включающий обоснование выбора направления исследований, методов и средств, способов решения задач, поставленных в рамках ПНИ. Проведение патентных исследований.
2. Изучение фенотипических, молекулярно-генетических и пробиотических свойств штамма Lactobacillus plantarum. Определение потенциала штамма Lactobacillus plantarum по продуцированию L-лизина in°situ.
3. Разработка лабораторного регламента получения биопрепарата с заданными составом и функциональными свойствами, включая методы контроля его функциональных свойств и качества.
4. Исследования потенциала биопрепарата по продуцированию L-лизина на свиньях и птице в условиях промышленного предприятия
5. Определение влияния биопрепарата на микрофлору кишечника птицы и свиней с помощью молекулярно-генетических методов.
6. Изучение возможности применения биопрепарата при проведении мероприятий по профилактике заболеваний свиней и птицы
7. Разработка рекомендаций по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики
8. Разработка ТЭО по применению биопрепарата и технического задания на разработку проекта опытно-промышленной установки по его производству.
Актуальность и новизна исследования
Проведен аналитический обзор информационных источников, в результате которого установлено, что совершенствование свойств пробиотических штаммов-продуцентов лизина, поиск способов стимулирования биосинтеза аминокислоты и увеличения выхода, создание и скрининг суперпродуцентов лизина являются актуальным направлением биотехнологии.
Разработана Методика контроля и идентификации штамма Lactobacillus plantarum, которая включает в себя микробиологический анализ бакпрепарат; изучение культуральных, морфологических и биохимических свойств штамма; идентификацию микроорганизмов с использованием тест-систем API50CHCHL; генотипические исследования, в.т.ч. проведение анализа 16SрРНК и проведение идентификации штаммам методом ПЦР с использованием видоспецифических праймеров; фингерпринт штамма.
Разработан лабораторный регламент получения биопрепарата с заданными составом и функциональными свойствами. Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента лактобактерий, которая позволяет масштабировать процесс в полупромышленных условиях.
Получен биопрепарат на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211, обладающий лизинсинтезирующими свойствами в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных.
Разработана Методика проведения T-RFLP-анализа микрофлоры моногастричных животных, основанная на методе T-RFLP-анализа.
Результаты исследований подтвердили возможности применения биопрепарата на основе штамма Lactobacillus plantarumL-211 для улучшения продуктивности свиней и бройлеров.
Описание исследования

Были использованы классические, в соответствии с ГОСТами, аналитические, физиолого-биохимические, молекулярно-генетические, в т.ч. T-RFLP-анализ микрофлоры ЖКТ, микробиологические, культуральные, физико-химические методы, их модификация, а также вновь разработанные методы.

Идентификация микроорганизма проводилась в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ (Аргентина, 2001; Канада, 2002), а именно: идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) рекомендуется проводить методом пульс-электрофореза в полиакриламидном геле или же методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК. Таксономический статус микроорганизма устанавливается на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией, используя такие методы, как ДНК-ДНК гибридизация, сиквенс 16S рРНК и др. Окончательно для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, должны быть использованы молекулярно-биологические базы данных, такие как база данных по рибосомам.

Для определения плазмидного профиля используется метод идентификации, разделения и очистки фрагментов ДНК. Для этого фрагмент линейной двухцепочной ДНК помещается в поле электрического тока. Для начала необходимо выделить плазмидную ДНК бактериальной клетки.

Определения содержания лизина осуществлялось методом ТСХ с хроматоденситометрией в культуральной жидкости с предварительным выращиванием штамма-продуцента в минеральной среде определенного состава.

Определение вирулентности, токсигенности, токсичности, безвредности и острой токсичности, хронической токсичности штамма осуществлялось в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.2.2602-10.

Для изучения адгезивных свойств штамма Lactobacillus plantarum L-211 в качестве модельной системы пищеварительного тракта использовали линию клеток CaСo-2 (эпителиоподобные клетки аденокарциномы ободочной кишки человека) в монослое. Установлено, что штамм характеризуется среднеадгезивными свойствами.

Для оценки физиологической активности штамма Lactobacillus plantarum L-211на биосистемы in vitro были использованы следующие клеточные линии: Flech (ФЛЭЧ-104) – фибробласты легкого эмбриона человека; NCTC – подкожная соединительная ткань, мышь, клон 929;CaСo-2 – аденокарцинома ободочной кишки человека (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург).

Отношение штамма Lactobacillus plantarum L-211 к антибиотикам различных групп было определено диско-диффузионным методом с помощью октодисков фирмы «Hi-media» (Индия).

Изучение состава микробиоценоза свиней и бройлеров проводили молекулярно-генетическим методом на основе T-RFLP-анализа. Была оценена численность (%) бактероидов, молочнокислых бактерий, бифидобактерий, энтеробактерий, целлюлозолитических бактерий, клостридий, патогенных бактерий в содержимом кишечника бройлеров и свиней.

Разработаны программа и методики исследовательских испытаний полифункционального биологического препарата для обеспечения сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы L-лизином in situ.

Тестирование функциональных свойств биопрепарата in vivo проводилось по следующим показателям: бифидогенная активность; уменьшение ввода синтетического лизина в рационы птицы и моногастричных животных; конверсия кормов в организме птицы и моногастричных животных; сохранность сельскохозяйственной птицы и моногастричных животных.

Кормленческие и балансовые опыты на свиньях и бройлерах были оценены по следующим показателям: сохранность поголовья путем учета отхода и установления его причин, %; живая масса в динамике роста путем индивидуального взвешивания всего поголовья по группам; потребление кормов групповое, за весь период выращивания; затраты корма на 1 кг прироста живой массы в конце опыта; переваримость и использование питательных веществ корма, по результатам физиологического опыта; химический состав тканей и органов.

Результаты исследования

Определена степень чувствительности штамма Lactobacillus plantarum L-211 к антибиотикам различных групп. Анализ плазмидного профиля показал, что штамм не содержит плазмид, поэтому не несет в себе трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости, способных к горизонтальному распространению.

Установлено, что штамм способен продуцировать лизин при культивировании на минеральной среде – 148,4±4,45 мг/л.

По показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности, исследованным на мышах, штамм признан безопасным.

При исследовании иммуномодулирующих свойств установлено, что инактивированные температурой клетки штамма Lactobacillus plantarum L-211 и супернатант культуральной жидкости не оказывают критического влияния на рост и жизнеспособность нераковых клеточных линий, таких какFlech и NCTC, однако при воздействии на раковую линию CaСo-2 с увеличением концентрации и времени действия инактивированных клеток увеличивается процент мертвых клеток аденокарциномы.

Анализ содержания витаминов в печени бройлеров показал, что замена синтетического лизина препаратом на основе штамма Lactobacillus plantarum L-211 совместно с препаратом «Пролизэр-БиоР» способствовала большему накоплению в печени бройлеров витамина А – на 67,65 мкг/г, увеличило депонирование витамина А в печени цыплят второй и третьей опытных группы в сравнении с контролем на 89,74 и 95,01 мкг/г, соответственно. Вместе с тем у опытной птицы отмечено снижение депонирования витамина Е в печени в сравнении с аналогами из контрольной группы на 13,44; 16,84 и 15,08 мкг/г. По содержанию в печени витамина В2 закономерных различий между группами не отмечено.

Полученные данные по химическому и аминокислотному составу грудных мышц бройлеров согласуются с зоотехническими результатами выращивания бройлеров. Нехватка лизина в комбикормах бройлеров второй, третьей и четвертой опытных групп отразилась на меньшем содержании белка и лизина в грудных мышцах бройлеров этих групп, в сравнении с контролем на 0,87–1,69–0,28 и 0,03–0,22–0,02%. В целом же содержание незаменимых аминокислот снизилось в сравнении с контролем на 0,11; 0,86 и 0,12% во второй, третьей и четвертой группах, соответственно.

Как у поросят опытной, так и контрольной группы количественные изменения всех субпопуляций Т-лимфоцитов, IgM и IgG происходят в сторону их увеличения, что обусловлено возрастной спецификой. Однако у животных опытной группы эти показатели были значительно выше, чем у особей из контрольной группы. Предлагаемый препарат стимулирует образование и выход малодифференцированных Т-лимфоцитов; функционально зрелых и Т-киллеров; Т-индукторов-хелперов; Т-супрессоров; Т-активных лимфоцитов, т.е. полипептидов, участвующих в организации иммунного ответа.

T-RFLP-анализ микрофлоры животных показал, что содержание лактобактерий микроорганизмов в толстом кишечнике свиней и в слепых отростках ЖКТ бройлеров всех групп находилось в пределах нормы, со значительным повышением их доли во 1 и 2 вариантах, где вводился лизинсинтезирующий штамм.

Практическая значимость исследования
Разработан опытно-промышленный регламент на получение биопрепарата с учетом способа определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест-систем (заявки на патенты № 2015155737 РФ и № 2015155738 РФ). Проведена наработка биопрепарата с оптимизацией технологических параметров на основе опытно-промышленного регламента ООО «Биореактор».
При откорме и доращивании свиней на промплощадке ООО «Новгородский Бекон» конверсия кормов при использовании лизинсинтезирующих пробиотиков составила: доращивание 1,997 (контроль) и 1,950 (опыт); откорм 2,64 и 3,10 – контрольные две группы, средняя величина 2,88; 2,73 и 3,0 – опытные две группы, средняя величина 2,81. Показатели опытного стада по среднесуточному привесу в стадии доращивания превышают показатели контрольного стада на 6,9%, а в стадии откорма – на 7,5%.
Установлено что, комплектуя опытные группы в процессе доращивания и откорма и при выпаивании один раз в семь дней препаратом на одну голову не менее 109 КОЕ, производитель может получить валовый доход 6–10 %.
На предприятии «Птицефабрика в Белоусово» биопрепарат использовался через систему поения. Установлено, что вырос суммарный индекс продуктивности (с 278 до 300) и увеличился общий выход мяса на площадь клетки (с 53,5 кг/кв.м. до 56,0 кг/кв.м.). Показатель конверсии (расход корма на 1 ц привеса) уменьшился с 1,72 до 1,66;среднесуточный привес увеличился с 50,2 г до 52,8 г.
Сбалансированы ингредиенты кормов для замены монохлоргидрат лизина и определена возможность применения штамма Lactobacillus plantarum для синтеза лизина в дефицитных по лизину комбикормах для цыплят-бройлеров. Создана экспериментальная рецептура корма.
Коммерческий эффект при применении препарата в стадии доращавания и откорма свиней составил в среднем 7%, а при выращивании бройлеров – порядка 10%.
Предварительный экономический анализ результатов ПНИЭР говорит о высокой эффективности применения биопрепарата как в свиноводстве, так и в птицеводстве.