Регистрация / Вход
Прислать материал

14.575.21.0065

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.575.21.0065
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"
Название доклада
Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.
Докладчик
Набиев Игорь Руфаилович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1. Разработка экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови.
2. Создание экспериментального образца регенерируемого нанопроволочного биосенсора для регистрации белковых маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови, разрабатываемого на основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) «сэндвич»-типа.
3. Достижение более высокой (в сравнении с аналогами) аналитической чувствительности экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора.
4. Обеспечение возможности многократного использования экспериментального образца регенерируемого нанопроводного биосенсора.
Актуальность и новизна исследования
Одной из актуальных задач современной медицины является ранняя диагностика онкологических заболеваний, которые входят в перечень социально-значимых заболеваний человека, утвержденный Правительством РФ В результате аномальной экспрессии генов, в опухолевых клетках продуцируются онкомаркеры – опухолевые антигены, содержание которых в биологических жидкостях и тканях являются важнейшим информативным показателем развития опухолевого процесса. Диагностика наличия онкомаркеров позволяет выявить болезнь на ранних стадиях, а также оценить эффективность проводимой терапии. Несмотря на то, что на настоящий момент уже известны более 200 онкомаркеров (и все новые специфические онкомаркеры продолжают выявляться), их детекция и связанная с этим клиническая диагностика эффективны пока лишь для некоторых видов рака. Разработка и совершенствование методов детекции онкомаркеров является одной из приоритетных задач современной медицины от решения которой зависит судьба миллионов людей.
Задачей настоящего ПНИ является создание экспериментального образца инновационной диагностической системы, основанной на регенерируемом нанопроволочном биосенсоре для одновременной регистрации ряда онкомаркеров в сыворотке крови. Данная система будет обладать большей чувствительностью при использовании меньших количеств биоматериала по сравнению с традиционной широко используемой системой на основе ИФА.
Описание исследования

На первом этапе исследования проведено математическое моделирование распределения электромагнитной волны в фотонной структуре (методом FDTD) и оптимизация параметров планируемой к созданию фотонной структуры для получения максимального сужения и усиления сигнала введенного флюорофора. В качестве базовой структуры сенсора выбран двумерный фотонный кристалл, сформированный массивом нанопроволок.

Создана подложка биосенсора, представляющая собой упорядоченный массив нанопроволок, формирующих двумерную фотонную структуру. Подложка сформирована через металлическую (никелевую) маску при помощи методики реактивного ионного травления (РИТ, RIE). Данный процесс позволяет травить кремниевую пластину анизотропно, в отличие от жидкостного химического травления. Металлическая маска сформирована методом электронно-лучевой литографии (ЭЛЛ, EBL), отличающимся высокой разрешающей способностью, достигающей 10 нм, а также высокой повторяемостью размеров структур, формируемых внутри массива (погрешность составляет порядка 1%). В дальнейшем, поверхность подложки подвергнута электрохимическому травлению для придания ей пористости и увеличения площади поверхности сенсора.

На третьем этапе, аналитическая площадь поверхности сенсора (а именно, поверхность нанопроволок) сделана полярной и функционализирована для последующей конъюгации с антителами, способными специфично распознавать онкомаркеры. Процесс модификации поверхности кремниевых нанопроволок включает:

- термическое окисление поверхности массива нанопроволок на глубину до 10 нм с целью введения активных силанольных групп Si-(OH)2, пригодных для проведения дальнейшей функционализации;

- силанизацию: модификацию окисленной поверхности массива нанопроволок 3-аминопропилтриэтоксисиланом с целью введения на поверхность нанопроволок функциональных аминогруп ( NH2);

 - введение на поверхность нанопроволок карбоксильных групп для последующей ковалентной пришивки распознающих антител, производимое посредством обработки поверхности сенсора ангидридом янтарной кислоты;

На четвертом этапе поверхность нанопроволок активирована путем введения бифункциональных сшивающих реагентов. Затем активированная подложка приведена в контакт с распознающими антителами, которые необратимо свяжутся с поверхностью подложки посредством образования ковалентных связяй.

Синтезированы высоколюминесцентные квантовые точки на основе селенида кадмия, имеющие квантовый выход (КВ) люминесценции не менее 90% в органической фазе. Далее произведена их обработка производными полиэтиленгликоля (ПЭГ), содержащими карбоксильные, гидроксильные, или аминогруппы, а также их смесями с контролируемым процентным содержанием каждого производного ПЭГ, для перевода КТ в водную фазу с сохранением КВ не менее 50%. Очистка суспензий солюбилизированных КТ от избытка ПЭГ осуществляется методом гель-проникающей хроматографии.

Методика регистрации белков - маркеров рака молочной железы и рака простаты в образцах сывороток крови человека включает следующие этапы:

- блокировка биосенсора с иммобилизованными на его поверхности антителами с помощью буферных растворов, содержащих бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин, для предотвращения неспецифического связывания биомолекул и биоконъюгатов с поверхностью биосенсора;

- нанесение в лунки  биосенсора образцов сыворотки крови человека и контрольных образцов; инкубация в течение 40-60 минут;

- отмывка биосенсора от анализируемых растворов;

- нанесение растворов конъюгатов КТ с детекторными антителами, специфичными к онкомаркерам; инкубация;

- отмывка биосенсора от избытка несвязавшихся конъюгатов;

- анализ флуоресценции биосенсора, который будет осуществляться на стандартном оборудовании для анализа флуоресценции в планшете для ИФА;

Регенерация заключается в промывке биосенсора специальным регенерирующим раствором, который разрушает специфические связи антиген-антитело, но при этом позволяет сохранить пространственную структуру и активность иммобилизованных на подложке антител. 

Результаты исследования

Разработан метод изготовления массива нанопроволок на кремниевой подложке и оптимизированы параметры его изготовления. Разработанная подложка экспериментального образца биосенсора будет представлять собой пластину кремния с расположенными на ней 6 аналитическими лунками диаметром 7 мм, что соответствует стандартной лунке 96-луночного планшета, соответствующего стандарту ANSI/SLAS 4-2004 "for Microplates – Well Positions". Методом коллоидного синтеза в органической среде были изготовлены высоколюминесцентные квантовые точки CdSe/ZnS, имеющие квантовый выход фотолюминесценции >90% в органической фазе. Получен ряд водорастворимых КТ, стабилизированных различными производными полиэтиленгликоля с различными значениями поверхностного заряда. Полученные образцы водорастворимых КТ обладают квантовым выходом люминесценции 57% и стабильны в водных растворах при физиологических значениях рН. Проведена иммобилизация как модельных, так и целевых антител на поверхность нанопроволочного массива. Разработанный способ корпусирования показал по результатам испытаний полную совместимость со стандартными флуоресцентными ридерами. Экспериментальные образцы конъюгатов детекторных антител с квантовыми точками выдержали испытания: на гистограмме распределения частиц по гидродинамическому диаметру имелся один симметричный пик со средним значением не более 30 нм.

Определены оптимальные параметры массивов нанопроволок и их морфологии: гексагональная структура с размером ячейки 280 нм, диаметром проволоки 100 нм и высотой 600 нм. Показано, что расстояние между нанопроволоками во многом играет определяющую роль с точки зрения достижения максимальной чувствительности. Установлено, что оптимальные по своим характеристикам биосенсоры могут быть сконструированы на основе массивов нанопроволок со следующими параметрами: расстояние между нанопроволоками – 280 нм, диаметр единичной нанопроволоки – 100 нм. Окисление поверхности нанопроволок необходимо проводить в растворе серной кислоты и перекиси водорода в соотношении 3/1, разбавленном деионизованной водой в 3 раза, в течение 2 часов. Для прочного связывания и сохранения биосенсорами высокой эффективности детекции целевых белков оптимальным является проведение ковалентного связывания антител с помощью карбодиимидной реакции в течении 30 минут и при 25°С. Показано, что наиболее эффективен регенерирующий раствор, представляющий собой 0,1М глицин – HCl буфер, рН 2,8. Были изготовлены стабильные и функционально активные конъюгаты КТ (с максимумом флуоресценции при длине волны 560 нм) с моноклональными антителами, специфичными к CEA и CA 27.29 в количестве 0,4 мг и 0,3 мг соответственно Изготовлены экспериментальные образцы биосенсора

Практическая значимость исследования
Областью применения ожидаемых результатов является лабораторная клиническая диагностика онкологических заболеваний и, в частности, обнаружение онкозаболевания на ранних стадиях развития, когда патологический очаг невозможно диагностировать другими методами. Онкомаркеры позволяют диагностировать опухоли и обнаружить метастазы за несколько месяцев до их обнаружения инструментальными (рентгенография, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование), цито- и гистологическими методами. Одновременная диагностика нескольких маркеров (например, маркеров рака молочной железы CEA, CA 15-3, CA 27.29) в формате одного биосенсора позволит провести комплексный анализ и при этом сэкономить биоматериал и уменьшить количество затрачиваемого времени на анализ.

Не менее значимым является контроль содержания онкомаркеров в крови для оценки эффективности терапии, раннего выявления рецидивов и метастаз. Несмотря на то, что на данный момент известно более 200 онкомаркеров, в клинической практике используют только около 20 из них. Ограничение их использования связано с большой вариабельностью результатов в зависимости от конкретного пациента, сложностью трактовки результатов анализа, а также с тонкими отличиями в методах отбора и обработки биологических проб, что может приводить к серьезным систематическим ошибкам. Однако, и сейчас в научных лабораториях ведутся активные поиски новых онкомаркеров, которые могут быть внедрены в клиническую практику, обеспечивая большую чувствительность и надежность проводимых анализов. Принципиальная схема биосенсора, предлагаемая в настоящем проекте, может быть адаптирована для анализа не только онкомаркеров рака молочной железы и рака простаты, но и других видов рака. Кроме того, после замены используемых в разрабатываемом прототипе антител на антитела, специфичные к биомаркерам других социально-значимых заболеваний, создаваемая диагностическая система будет применима для всех видов анализа, в основе которых лежит принцип ИФА.
Постер

Poster_0065_5_etap.ppt