14.607.21.0067

Целью данного проекта является создание аналитических тест-систем для персонифицированной идентификации динамических биомаркеров (изменений транскриптомы), характеризующих персонифицированную восприимчивость к онколитической биотерапии для диагностики или типирования онкологических заболеваний, а также создание экспериментальной панели самонацеливающихся штаммов онколитических вирусов для онколитической биотерапии.

Разработанная технология персонифицированной медицины, позволяющая делать прогноз об эффективности онколитической биотерапии и подбирать оптимальный курс лечения, несомненно будет востребован в онкологических клиниках и позволит существенно повысить выживаемость пациентов, особенно в далеко зашедших случаях, характеризующихся появлением метастазов. Разработанная аналитическая система позволит проводить сравнение экспрессии генов в ходе опухолевой прогрессии, и по ходу лечения. Она может найти широкое применение в онкологических клиниках. Разработанные диагностические тесты на выявление биомаркеров, характеризующих чувствительность к тем или иным штаммам онколитических вирусов найдут широкое применение и будут востребованы для предсказания эффективности биотерапии. Разработанные новые штаммы онколитических вирусов с расширенным спектром воздействия на опухоли будут переданы индустриальному партнеру для проведения доклинических и клинических испытаний и последующего внедрения в клиническую практику в соответствии с разработанными рекомендациями по определению индивидуальной чувствительности опухолей пациентов. Использование панелей вирусов вместо отдельных онколитических вирусов может существенно повысить эффективность лечения, поскольку позволит применять несколько вирусов один за другим, тем самым повышая время терапевтического воздействия. Разработанные биомаркеры выведут метод онколитической терапии на новый качественный уровень и сделают его предсказуемым, а следовательно, существенно повысят эффективность терапии.

Наиболее подходящим методом для быстрого определения уровня экспрессии небольшого числа генов - биомаркеров, является ПЦР в реальном времени (рвПЦР). На основе этого метода создан ряд методик и коммерчески доступных решений для оценки дифференциально-экспрессирующихся генов в образцах человеческих тканей. Разрабатываемые узкоспециализированные аналитические системы, полностью оптимизированные под решение конкретной задачи, в связи с фиксированным набором анализируемых транскриптов, могут быть эффективно реализованы на основе метода мультиплексной ПЦР в реальном времени с предшествующей пробоподготовкой, включающей этапы выделения РНК и проведения ревертирования со специфическими праймерами.

Целью исследования является разработка методики мультиплексной ПЦР в реальном времени для анализа уровней экспрессии генов-биомаркеров в злокачественных опухолях у человека, для проведения персонифицированной оценки потенциала новых виротерапевтических агентов.

Все производимые манипуляции с ними следует проводить в условиях, препятствующих возможному перемешиванию образцов.

кДНК, полученная в ходе ревертирования тотальной РНК образцов клеток злокачественных опухолей, должна содержаться в условиях, исключающих контаминацию праймерами или зондами.

Подготовленные для МПЦР реакционные смеси должны храниться не более 4 часов при температуре 4°С.

Все гены, анализ которых проводится в пределах одной реакционной смеси должны иметь сходную эффективность амплификации, отработка которой обуславливает репрезентативность полученных данных.

В ходе подбора последовательностей праймеров и зондов должен проводиться анализ олигонуклеодитов, участвующих в одной реакционной смеси на предмет их потенциального взаимодействия друг с другом и образования праймер-димеров .

ПРОВЕДЕНИЕ ОПЕРАЦИИ:

1.    кДНК, полученную после ревертирования в объеме 30-20 мкл вортексируют и осаждают на микроцентрифуге.

2.    Для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени готовят реакционную смесь в объеме 25 мкл , содержащую 2.5 мкл 10x Taq буфера, 200 мкМ dNTP, 5 мМ MgCl2, 4 пары праймеров каждый по 300 нМ, 4 зонда каждый по 250 нМ, 1 ед. HS Taq полимераза, 1 мкл раствора анализируемого разведения кДНК.

3.    Помимо эндогенного контроля в виде референсных генов-хаускиперов, готовят 2 контрольных образца, содержащих плазмидную ДНК, кодирующую последовательность гена GAPDH.

4.    ПЦР с измерением интенсивности флуоресценции проводят по следующему алгоритму: 95 °С - 10 мин, далее 40 циклов: 95 °С — 15 сек, 55 °С - 30 сек, 72°С - 30 сек.

5.    После проведения МПЦР также проводили анализ кривых плавления (Melting Curves)

4.    Данные о кривых флуоресценции, кривых плавления по всем образцам агрегируются и проводится построение кривых эффективности на основе 3х точек, соответствующих 3м исследованным разведениям.

5.    В случае срабатывания положительного контроля, воспроизводимости результатов среди биологических повторностей и подтверждения правильности кинетики МПЦР может проводиться расчет результатов количественного анализа уровня экспрессии биомаркеров.

6.     Для математической обработки данных ПЦР-РВ можно использовать программу «АТГ» («Анализ Транскрипции Генов», Свидетельство № 2008612585, 2008, Роспатент, РФ). Оценку уровня мРНК оптимально проводить с использованием ДДЦ-метода и учетом эффективностей всех реакций.

 

 

 

 

В рамках реализации проекта был осуществлен сбор биологических образцов биоптатов злокачественных опухолей человека (рак молочной железы, рак легкого, рак простаты, рак поджелудочной железы, злокачественные глиомы мозга) и сформирована обширная коллекция криопрезервированных образцов (более 346 образцов - 2254 ампулы).

Были клонированы и наработаны штаммы онколитических вирусов, включающая следующие штаммы: EСНОб, ЕСН07, ЕСН021, Коксаки А7, Коксаки А9, Коксаки B1, Коксаки B3, Коксаки B4, Коксаки B6, Реовирус 1 типа (штаммLang), Реовирус 2 типа (штамм Jones), Реовирус 3 типа (Штамм Dearing), Вирус кори (штамм ЭдмонстОн), вирус болезни Ньюкастла и вирус везикулярного стоматита.

Были разработаны эффективные методики получения органных культур из образцов биоматериала, и исследована избирательная способность 15 штаммов онколитических вирусов размножаться и убивать модельные культуры 11 злокачественных опухолей. Разработана методика оценки онколитической активности исходных 15 штаммов онколитических вирусов из исходной панели в органной культуре злокачественных опухолей человека.

Разработана методика проведения и осуществлено параллельное секвенирование транскриптома 229 биологических образцов злокачественных опухолей пациентов и 11 модельных линий. Проведен анализ 240 транскриптом опухолевых клеток с учетом тканевой принадлежности опухоли для идентификации биомаркеров чувствительности клеток к штаммам онколитических вирусов исходной панели. Создан и усовершенствован алгоритм выявления биомаркеров чувствительности клеток к штаммам онколитических вирусов исходной панели. На основе результатов по изучению репликативной способности исследуемой панели онколитических вирусов при размножении в модельных культурах злокачественных опухолей человека, с искусственно модифицированной экспрессией выявленных на предыдущих этапах проекта биомаркеров, был сформирован итоговой перечень предсказательных биомаркеров для персонифицированного анализа чувствительности опухоли пациента к панели вирусов.

В результате был сформирован перечень из 57 биомаркеров, получены рекомбинантные лентивирусные конструкции, экспрессирующие кДНК выявленных биомаркеров, для гиперэкспрессии и конструкции для РНК-интерференции и подавления экспрессии выбранных биомаркеров в модельных линиях клеток злокачественных опухолей человека. Получены модельные культуры клеток злокачественных опухолей с измененной экспрессией выявленных биомаркеров. Разработана методика оценки онколитической активности исходных 15 штаммов онколитических вирусов из исходной панели в органной культуре злокачественных опухолей человека. Разработана методика оценки изменчивости и произведен выбор штаммов для создания экспериментальной панели из 5 самонацеливающихся штаммов онколитических вирусов - вируса кори, Коксаки ВЗ, Коксаки Вб, Коксаки А7 и вируса Эхо 7.

Сформирован перечень биомаркеров для персонифицированного анализа чувствительности опухоли пациента к панели вирусов

Данный перечень включил в себя 22 уникальных биомаркера: 5 биомаркеров для вируса кори (гены DNAJC24, IL1RAPL2, LEPR, PDDC.1L и ТМЕМ54), 4 биомаркера для вируса Коксаки ВЗ (гены IL8, MAP3K13, SCARB2 и TRAF4), 3 биомаркера для вируса Коксаки Вб (гены ДЛ5, FGF5 и MDK), 5 биомаркеров для вируса Коксаки А7 (гены CD74, CSF3, МАРКАРКЗ, TNFAIP6 и TNFRSF1B) и 5 биомаркеров для вируса Эхо 7 (гены CFI, HCFC2, ИСК, ITGA7 и STK4).

Онколитическая биотерапия рака, особенно использование для терапии непатогенных штаммов вирусов, является многообещающим инновационным подходом, который в последние годы неуклонно пробивает дорогу в клинику. Осознание ограниченности метода цитотоксической химиотерапии, высокая частота рецидивов, стимулирует развитие альтернативных подходов к лечению метастатического рака. Использование живых вирусов для борьбы с раком делает возможным создание таких живых систем, которые способны к мутационной адаптации и приобретению способности к уничтожению возникающих в ходе опухолевой прогрессии неустойчивых к терапии клеток. Такая гибкая адаптация невозможна в случае применения химических соединений, антител, да и вообще любых «неживых» терапевтических средств. Вирусы как терапевтические средства безусловно имеют потенциал в ближайшие годы стать одним из основных классов противоопухолевых средств. Разработка огромного многообразия терапевтических штаммов и индивидуальная чувствительность к ним очень гетерогенных опухолевых клеток ставит в качестве важнейшей задачи вопрос о возможности предсказания эффективности терапии и выборе наиболее действенного варианта. Незнание индивидуальных особенностей опухолевых клеток пациента делает метод онколитической терапии непредсказуемым, что отражается в пока еще мало впечатляющих результатах клинических испытаний. Метод определения индивидуальной чувствительности опухоли конкретного пациента позволит вывести онколитическую биотерапию на новый качественный уровень и обеспечить предсказуемость лечения и успех клинических испытаний, при которых подбор пациентов и применяемых онколитических препаратов будет проводиться строго в соответствии с индивидуальными особенностями заболевания. В связи с этим наша разработка, безусловно, будет востребована во многих онкологических клиниках, как в России, так и за рубежом.
В России результаты данной разработки будут востребованы в ряде ведущих онкологических клиник, в том числе, в Российском онкологическом научном Центре РАМН, Институте онкологии им. Петрова (СПБ), институте онкологии им. Герцена (Москва), институте нейрохирургии им. Бурденко, клинике Им. Мешалкина СЩ РАН (Новосибирск) и других.