Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0053

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0053
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук"
Название доклада
Изучение биологической опасности нетермического воздействия терагерцового излучения на бактерии и клетки человека
Докладчик
Пельтек Сергей Евгеньевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель работы - изучение биологических эффектов нетермического воздействия терагерцового излучения (ТГИ) на модельных объектах: бактериях Escherichia coli, тестовой системе Эймса на бактериях Salmonella typhimurium а также на культуре эпителиальных клеток человека для определения степени биологической опасности данного вида излучения для человека.
Настоящий проект выполняется в рамках сотрудничества с Оксфордским Университетом и включает в себя следующие задачи: облучение геносенсоров и анализ их ответа на ТГИ; выполнение теста Эймса и SOS-хромотеста для оценки мутагенного и генотоксического действия ТГИ; получение транскрипционных профилей E. coli под нетермическим воздействием ТГИ методом РНК-секвенирования; определение изменения экспрессии белков при нетермическом воздействии ТГИ на клетки Е. coli методами протеомного анализа; создание нового геносенсора на основе промотора гена, экспрессия которого в результате нетермического воздействия ТГИ увеличивается наиболее выраженно и тестирование этого геносенсора на способность к индукции ТГИ; анализ результатов протеомного и транскриптомного профилирования с использованием биоинформационных подходов и поиск биологических механизмов воздействия терагерцового облучения на биологические объекты; идентифицикация генов маркеров, индуцируемых нетермическим воздействием ТГИ в клетках человека с пониженным уровнем активности репарационных систем методом количественного протеомного анализа экспрессии генов; определение уровня экспрессии генов маркеров, индуцируемых при нетермическом воздействии ТГИ в культуре клеток человека методом вестерн-блот анализа.
Актуальность и новизна исследования
Терагерцовое излучение является неионизирующим и перспективным для применения в таких областях, как разработка систем безопасности в аэропортах или новых диагностических систем в медицине. ТГИ практически отсутствует в современной естественной среде обитания живых систем на планете Земля в силу интенсивного поглощения этого диапазона частот водой и ее парами в атмосфере. Поэтому исследование механизмов воздействия ТГц излучения на живые объекты, поиск и изучение специфических или общих защитных систем организмов, активирующихся на присутствие ТГИ, аналогично системам репарации и SOS-ответа живых объектов на ионизирующее электромагнитное излучение, является важной фундаментальной задачей. Проведение работ по изучению безопасности ТГИ возможно при использовании ЦКП «Синхротронного и терагерцового излучения» ИЯФ СО РАН, поскольку установка обеспечивает достаточную мощность терагерцового излучения. Новым подходом для оценки воздействия ТГИ на живые системы является применение геносенсорных конструкций, что позволило выявить не только возможное влияние терагерцового излучения на функционирование генетических систем у E. coli, но и подойти к изучению некоторых механизмов этого воздействия. Исследование влияния ТГИ на культуру клеток фибробластов актуально для изучения вопроса о вреде терагерцового излучения для здоровья человека.
Описание исследования

 В настоящем исследовании для оценки генотоксического и мутагенного потенциала терагерцового излучения были выбраны два стандартных бактериальных теста: SOS хромотест и тест Эймса и стандартные бактериальные штаммы - E. coli PQ37 и Salmonella Typhimurium TA 98 (hisD3052) и TA102 (hysG428), соответственно. Стандартный протокол тестов был адаптирован к условиям проведения эксперимента по облучению на биологической станции, что было связано с высоким требуемым количеством клеток при малом  объеме  кюветы для облучения.

Наиболее простым и удобным объектом для изучения нетермического  воздействия ТГИ на живые объекты является бактерия E. coli, генетика, молекулярная биология и метаболизм которой подробно изучены. Для запланированной в этом проекте работы на базе клеток E. coli сконструированы несколько геносенсоров – штаммов E. coli, окрашивающихся в зеленый цвет при активации определенной генетической системы внутри клетки. Применение геносенсорных конструкций позволило выявить индукцию стресс-реактивных систем, таких как системы окислительного стресса и поддержания гомеостаза переходных металлов на воздействие определенных доз ТГИ  и ее отсутствие для  системы детоксикации антибиотиков.

Анализ изменений транскриптома и протеома E. coli позволило идентифицировать гены, вовлеченные в реакцию клетки на нетермическое воздействие  терагерцового излучения и  обеспечивающие специфичный ответ клеток. Создание на базе промоторов этих генов геносенсорных конструкций позволит верифицировать протеомные данные на уровне регуляции экспрессии генов и  создать биологический детектор наличия терагерцового излучения. Для создания молекулярно-генетической конструкции на основе промотора гена, экспрессия которого в результате воздействия нетермического терагерцового излучения  меняется  (увеличивается) наиболее выражено,  использован базовый кассетный вектор на основе плазмиды pUC 18, содержащий ген флюоресцентного белка GFP. Изучение нетермического воздействия терагерцового излучения на экспрессию генома E. сoli  на уровне транскрипции проведено с использованием  метода RNA-seq. Сравнение транскриптомов облученных и интактных клеток позволило определить наиболее реактивные генетические системы E. сoli  по отношению к нетермическому воздействию терагерцового излучения. Анализ протеома контрольных и облученных клеток E. сoli проведен современными методами протеомного анализа, включающими двумерный электрофорез с последующей идентификацией белков или их фрагментов  методами  масс-спектрометрии. При этом для определения временных интервалов фиксации материала для протеомного анализа использована динамика ответа геносенсорной конструкции на облучение.

Для изучения нетермического воздействия ТГИ   на клетки человека была выбрана пассированная культура клеток фибробластов, поскольку пассирование обеспечивает возможность получения однородных популяций. Изучение нетермического воздействия ТГИ на клетки человека проведено при помощи современного метода количественной протеомики SILAC, основанного на масс-спектрометрическом анализе распределения меченых аминокислот в культуре контрольных и подвергнутых облучению клеток. Протеомный анализ клеток человека с пониженной способностью к репарации ДНК позволил установить селективные маркеры, индуцируемые при повреждении ДНК.

Результаты исследования

Первые эксперименты по облучению терагерцовым излучением клеточных культур были проведены в рамках «THz-BRIGE». Следует отметить  неоднозначность полученных результатов. Результаты этого проекта, как правило,  свидетельствовали об отсутствии генотоксических эффектов излучения, однако, было показано, что некоторые специфические условия облучения вызывают изменения в проницаемости мембран липосом и приводят к индукции генотоксичности в лимфоцитах.

 В основном, исследования эффектов терагерцового излучения на живые системы проводятся с использованием источников низкой интенсивности.  Тем не менее, даже при использовании источников терагерцового излучения низкой интенсивности обнаруживаются нетермические эффекты на уровне регуляции экспрессии генов. В исследованиях Александрова с соавторами методом RT-PCR установлено, что в мезенхимальных стволовых клетках мыши в результате длительного облучения (12 часов) излучением 2.52 THz даже очень низкой интенсивности (1мкДж) начинается дифференцировка клеток, при этом экспрессия генов теплового шока в облученных клетках находится на базовом уровне. В работе Hintzsche с соавторами не было обнаружено генотоксических эффектов излучения 0.380 и 2.520 TГц. Авторы использовали источник низкой интенсивности (0.03-0.9 мВ/см2), в этой ситуации отсутствие эффекта может быть обусловлено ограничением исследованных доз, хотя авторы и проводили довольно длительные эксперименты (до 8 часов).   Williams с соавторами облучали клетки эпителия и эмбриональные стволовые клетки человека терагерцовым излучением мощностью 24 мВт и не обнаружили значимых изменений морфологии, адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток.

В проекте выявлено отсутствие прямого мутагенного и генотоксического действия исследованных доз ТГИ на ДНК. Обнаружен разный уровень нетермической реакции стрессовых систем E. coli на ТГИ. Показано, что в ответе на однократное нетермическое воздействие терагерцового излучения задействованы системы окислительного стресса  и  гомеостаза ионов меди, а система детоксикации противомикробных агентов не задействована.Отсутствие индукции флюоресцентного белка GFP вследствие теплового шока свидетельствует о том, что активация геносенсоров ТГИ носит нетермический характер.

Разработаны методики для изучения ответа клеток E. coli на облучение на транскриптомном и протеомном уровнях. Изучение протеомного ответа клеток Е. сoli на нетермическое воздействие терагерцового излучения позволило установить гены и генетические системы ответа  на нетермическое воздействие терагерцового излучения. На основе гена glnA, реагирующего на облучение резким повышением экспресии был сконструирован геносенсор E.coli/glnA-gfp,  идуцируемый нетермическим воздействием ТГИ, который может быть использован в качестве детектора излучения.

Получены библиотеки кДНК, в результате секвенирования которых будут получены данные для биоинформационной обработки транскрипционных профилей E. coli, экспрессирующихся под нетермическим воздействием терагерцового излучения и в контроле для выявления дифференциально экспрессируемых генов.

Методом количественного протеомного анализа экспрессии генов в облученных культурах клеток фибробластов было продемонстрировано повышение экспрессии митохондриальных белков, вовлеченных в синтез АТФ.

Практическая значимость исследования
Основная область применения результатов проекта - биобезопасность неионизирующих излучений. Использования приборов и оборудования с излучением в различных диапазонах электромагнитного спектра является одним из факторов антропогенного воздействия на окружающую среду и, наряду с выбросами углекислого газа, химических соединений, тяжелых металлов и др., источником ее загрязнения.
В настоящее время на базе терагерцового излучения разрабатывается целый ряд приборов для имиджинга и детекции. Подобная техника перспективна для диагностики таких кожных заболеваний, как экзема, дерматит, рак, травмы кожных покровов, ожоги, томографии зубных тканей, диагностика атеросклероза. Широкополосное ТГц-излучение делает возможным спектральный анализ ткани, что позволит исследовать усвоение и эффективность применения лекарственных средств. Обсуждаются возможности резкого повышения разрешающей способности томографических исследований при переходе на терагерцовый диапазон частот.
В России основными разработчиками приборов утилизирующих свойства терагерцового излучения являются Московский государственнй университет, Московский физико-технический институт, Институт прикладной физики РАН и др.
Однако до внедрения приборов в повсеместную практику, необходимо тщательно изучить эффекты воздействия этого излучения на живые объекты и оценить параметры излучения как безвредные, так и предельно допустимые для облучения человека. В результате выполнения проекта проведено изучение механизмов воздействия терагерцового излучения на живые объекты и определение систем наиболее чувствительных к нему, что позволит сформулировать основные правила безопасного использования терагерцового излучения в практике. Важным шагом в этом направлении является установление самого факта воздействия этого излучения на живые системы и определение эффективных доз излучения. Кроме того, в результате выполнения проекта будет создан новый геносенсор, чувствительный к воздействию терагерцового излучения.
Результаты настоящих исследований дадут методическую и научную основы для разработки нормативных актов, регламентирующих применение терагерцового излучения в РФ и мире.