Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0015

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0015
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Разработка биотехнологических средств комплексного контроля пищевых продуктов и кормов на контаминацию микотоксинами.
Докладчик
Дзантиев Борис Борисович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель: разработка и испытание новых аналитических систем для контроля микотоксинов (афлатоксина В1, дезоксиниваленола, зеараленона, фумонизина, Т-2 токсина, охратоксина А) в сельскохозяйственном сырье и продуктах питания.
Задачи проекта: разработать, изготовить и апробировать экспериментальные образцы иммунохимических систем определения приоритетных микотоксинов, обеспечивающие экспрессный и высокопроизводительный контроль данных соединений. Преимущества разрабатываемых тест-систем:
1. Продолжительность от 10-15 минут (для экспрессного иммуноферментного или иммунохроматографического анализа) до 1 часа (для высокочувствительного иммуноферментного определения).
2. Достижение низких пределов обнаружения (до 0,15 нг/г пробы).
3. Высокая производительность (возможность одновременного определения нескольких десятков объектов).
Разрабатываемые решения позволят проводить комплексную оценку качества и безопасности сырья и продуктов питания, снизив тем самым негативное воздействие токсичных контаминант на население.
Актуальность и новизна исследования
Микотоксины являются одной из наиболее значимых групп токсичных контаминант пищевой продукции. В настоящее время для их контроля преимущественно используются газовая и жидкостная хроматографии —дорогие методы, реализуемые в централизованных лабораториях, что не позволяет обеспечить ни массового скрининга, ни оперативного получения результатов.
Альтернативным решением могли бы быть иммунохимические методы, характеризующиеся простотой реализации и низкими требованиями к приборному обеспечению. Однако недостаточная чувствительность и существенная длительность ограничивают их использование. Новые иммунохимические решения, сочетающие низкий предел обнаружения, высокую скорость анализа и простоту реализации, способны потеснить конкурентов и занять существенную нишу на рынке.
Достижение создаваемыми тест-системами такого комплекса свойств стало возможным благодаря использованию ряда реализованных инновационных идей: систем усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии, магнитного концентрирования и хемилюминесцентной детекции в иммуноферментном анализе.
Описание исследования

Разработка тест-систем состояла из следующих этапов:

1. Характеристика специфических реагентов – антител, конъюгатов микотоксин-белок-носитель и микотоксин-ферментная метка.

Проводилась оценка кинетических и термодинамических констант связывания с использованием безмаркерной биосенсорной системы на основе поверхностного плазмонного резонанса, а также диапазона определяемых концентраций антигенов в микропланшетном иммуноферментном анализе. На основании полученных экспериментальных данных отобраны реагенты, потенциально обладающие наибольшей эффективностью в иммунохроматографических и иммуноферментных аналитических системах.

2. Синтез и характеристика магнитных и золотых наночастиц и их конъюгатов.

Получены наночастицы – носители и маркеры для иммуноферментного и иммунохроматографического анализа. Экспериментально сопоставлены различные методы синтеза конъюгатов наночастиц с иммунореагентами, включая как адсорбционную, так и ковалентную иммобилизацию. Препараты охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Определены и сопоставлены диаметры наноразмерных носителей до и после конъюгирования с антителами к шести микотоксинам, оценена степень модификации поверхности наночастиц.

3. Определение степени сохранения иммунохимических свойств антител в составе конъюгатов с наночастицами.

С использованием методов иммуноферментного анализа проведена оценка доли реакционноспособных антител в составе конъюгатов. Проведен анализ зависимостей интенсивности окрашивания аналитических зон иммунохроматографических тестов от состава и свойств конъюгатов. Предложены подходы к проведению иммунохроматографии, позволяющие при минимальной концентрации антител обеспечить  достижение максимального связывания маркеров и, тем самым, минимальных пределов обнаружения.

4. Создание экспериментальных образцов тест-систем.

Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем трех видов для определения шести микотоксинов и установлены их аналитические параметры (пределы обнаружения, рабочие диапазоны анализа, воспроизводимость результатов). С использованием методов многомерной оптимизации для каждой из 18 тест-систем установлены концентрации как ключевых специфических компонентов, так и дополнительных реагентов (консервантов, стабилизаторов и детергентов), длительности стадий и составы реакционных сред, обеспечивающие максимальную чувствительность.

5. Разработка протоколов проведения анализа для трех типов тест-систем. Апробация экспериментальных образцов тестов для выявления микотоксинов в сельскохозяйственной продукции и продуктах питания.

Получены градуировочные кривые для определения микотоксинов в биопробах. Разработаны методы пробоподготовки растительного сырья. Проведена апробация экспериментальных образцов тест-систем для анализа растительного материала.

Результаты исследования

Достигнуты следующие результаты:

  1. Определены и обоснованы наиболее эффективные методики получения реагентов для тест-систем и контроля их функциональных параметров;
  2. Созданы тест-системы для определения микотоксинов с пределами обнаружения 0,15–10 нг/мл (в зависимости от соединения), длительностью 15–60 мин (в зависимости от аналитического метода);
  3. Подготовлены проекты инструкций к тест-системам и методических рекомендаций по их применению. Разработан лабораторный регламент изготовления экспериментальных образцов аналитических систем.

Изготовлены и апробированы экспериментальные образцы новых иммунохимических тест-систем трех видов:

  1. Тест-система для внелабораторного контроля продукции на основе иммунохроматографических тест-полосок, сочетающая простоту пробоподготовки, высокую скорость определения (менее 15 мин), степень выявления целевых соединений в сельскохозяйственной продукции и продуктах питания не менее 97%. Реализована новая схема анализа, в которой снижение расхода дорогих специфических иммунореагентов сочетается с повышением чувствительности. Разработанные системы превосходят коммерческие аналоги по чувствительности (инструментальный предел обнаружения Т-2 токсина 4 нг/г, тогда как у тест-системы RIDA®QUICK T-2 – 50 нг/г).
  2. Тест-система для высокочувствительного лабораторного контроля на основе иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией и концентрированием с помощью магнитных иммуносорбентов. Предложенный формат анализа позволяет одновременно осуществлять концентрирование аналита и его высокочувствительное детектирование. Разработанные системы по аналитическим характеристикам превосходят коммерческие аналоги (предел обнаружения афлатоксина В1 20 пг/г при продолжительности анализа 45 мин).
  3. Экспрессная иммуноферментная система с визуальной детекцией, позволяющая в минимально оборудованных условиях проводить высокочувствительный скрининговый анализ (продолжительность анализа, включая пробоподготовку, – менее 25 мин).

Имеющиеся на российском рынке импортные средства детекции микотоксинов не обеспечивают описанного выше сочетания чувствительности и экспрессности определения. Существующие в мировой практике решения для высокочувствительного анализа более сложны в реализации (требуют дополнительных стадий и реагентов) и не проработаны технологически (не решены вопросы стабильности и воспроизводимости). Предложенные в проекте концепции магнитного концентрирования без элюции и усиления аналитического сигнала в иммунохроматографии (непрямое введение маркера) являются новыми уникальными решениями.

Практическая значимость исследования
Высокая востребованность тест-систем для контроля микотоксинов определяется их ключевой ролью для оценки качества сельскохозяйственных культур. Объемы международной торговли такой продукцией, как пшеница, рис, ячмень, кукуруза, соя и масличные культуры, составляют сотни миллионов тонн в год. Более 25% продукции сельского хозяйства контаминировано микотоксинами. Только прямые потери и только обусловленные афлатоксином составляют полмиллиарда долларов в год. В зависимости от уровня микотоксинов определяется сортность пшеницы, что может оказать радикальное влияние на экспортный потенциал отечественной продукции. Исходя из этого, своевременный и тщательный контроль содержания микотоксинов как в готовой продукции, так и на всех стадиях ее производства является неотъемлемой и важной частью повышения экономического благосостояния страны.
Реализованный проект непосредственно направлен на создание и характеристику прототипных образцов иммуноаналитических систем, которые рассматриваются как объекты последующих опытно-конструкторских работ. Активное распространение на рынке импортных иммунохимических средств контроля микотоксинов говорит об их высокой востребованности в производственной и сельскохозяйственной практике.
Вывод на рынок отечественных аналитических систем в кооперации с индустриальным партнером ООО «Русхимбио» позволит провести импортозамещение продукции, тем самым снизив расходы и повысив экономическую эффективность сельскохозяйственной и пищевой отрасли.
Постер

Poster_0015F.ppt