14.584.21.0006

Целями проекта являются создание и отработка методик получения конъюгатов квантовых точек - полупроводниковых функционализированных флуоресцентных наночастиц - с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов из ядов змей. Кроме того, в рамках проекта проводится разработка методов их применения в качестве маркеров соответствующих рецепторов в клетках и тканях. Полученные конъюгаты токсинов с флуоресцентными наночастицами в дальнейшем могут быть использованы в научных исследованиях, медицине и для создания тест систем, они также могут применяться для выявления особенностей строения и распределения рецепторов в тканях в норме и при патологиях, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания.

Одной из основных задач современной биотехнологии является развитие сверхчувствительных и высокопроизводительных методов быстрого детектирования белков, генов и клеток. Возможность быстрого определения большого числа биологических молекул с чувствительностью на уровне единичных молекул необходима для дальнейшего развития таких областей, как медицинская диагностика и разработка новых лекарств. Перспективными в этом отношении являются полупроводниковые нанокристаллы, обеспечивающие очень яркий сигнал и обладающие высокой фотостабильностью. Применение полупроводниковых нанокристаллов может существенно расширить возможности визуализации многих биологических процессов. Использование нанокристаллов может стать основой новых неразрушающих методов визуализации рецепторных молекул и маркеров заболеваний. Разработка и применение конъюгатов полупроводниковых нанокристаллов является одной из задач, решаемых в данной работе. Получаемые конъюгаты предназначены для визуализации биологических процессов, протекающих в клетках, включая идентификацию трансформированных клеток. Картирование распределения маркеров опухоли, проводимое в формате клинического теста, представляет собой шаг к медицине будущего, а появление технологии точной оптической локализации лекарственных препаратов может существенно облегчить разработку лекарств новых поколений.

В ходе выполнения данного исследования был использован целый ряд современных методов и методик. Так, для синтеза флуоресцентных наночастиц (квантовых точек, полупроводниковых нанокристаллов) сульфида цинка и селенида кадмия CdSe использовался коллоидный метод. Синтез проводили при комнатной температуре (295 K). Коллоидный метод позволяет получать квантовые точки, как в виде простых ядер, так и ядер с оболочками, обеспечивающими водорастворимость, биосовместимость и долгосрочную стабильность свойств. Наночастицы CdSe покрыты оболочкой сульфида цинка как полупроводника с достаточно широкой запрещенной зоной. Синтезированные в данной работе наночастицы типа ядро/оболочка CdSe/ZnS исследованы с использованием различных методов – оптической и флуоресцентной спектроскопии, методом лазерного динамического рассеяния, электронной просвечивающей микроскопии, анализа дзета-потенциала.

Выделение альфа-нейротоксинов и фактора роста нервов из ядов для получения их конъюгатов с флуоресцентными наночастицами проведено с применением современных видов классической и высокоэффективной жидкостной хроматографии, их структура охарактеризована методами масс-спектрометрии и белковой химии. Конъюгаты квантовых точек с токсинами синтезированы с использованием разработанных в данной работе и основанных на имеющихся в современной научной литературе методик, которые обеспечивают стабильность полученных конъюгатов как при хранении, так и при проведении исследований в физиологических условиях. Стабильность полученных конъюгатов обеспечена модификацией поверхности флуоресцентных наночастиц из CdSe в оболочке из ZnS тиол-содержащим трипептидом глутатионом. Эта же модификация обеспечивает биосовместимость конъюгатов. Для обеспечения ковалентного связывания функционализированных полупроводниковых наночастиц с токсинами использован метод создания амидной связи путем активации карбоксильных групп водорастворимым карбодиимидом. Разработанная методика ковалентной конъюгации поверхностно модифицированных флуоресцентных нанокристаллов с полипептидами может применяться для синтеза конъюгатов различных белков и пептидов с поверхностно модифицированными наночастицами разных типов.

Биологическую активность полученных конъюгатов исследовали с применением методов флуоресцентной микроскопии и радиолигандного анализа. В качестве источников рецепторов альфа-нейротоксинов и нейротрофинов использовали мембранные препараты никотиновых холинорецепторов, в частности, из электрического органа ската Torpedo californica, а также клеточные линии, экспрессирующие высокий уровень рецепторов Trk A, в частности, клеточную линию РС12 феохромоцитомы крысы.

В результате выполнения проекта разработаны методики и осуществлен синтез флуоресцентных наночастиц с различными оптическими характеристиками. Так, проведен синтез полупроводниковых флуоресцентных наночастиц со средним размером менее 20 нм и выделены из ядов токсины с чистотой не ниже 95%. Спектр флуоресценции полупроводниковых нанокристалов находится в диапазоне от ~ 500 нм до 670 нм в зависимости от размера наночастиц. Проведено сравнительное исследование методов фунционализации поверхности флуоресцентных наночастиц и выполнена их поверхностная модификация с использованием различных реагентов. Разработаны методики и осуществлена конъюгация флуоресцентных наночастиц с токсинами, разработаны методы очистки конъюгатов. Разработанные методы конъюгации обеспечивают ковалентное связывание альфа-нейротоксинов и фактора роста нервов с наночастицами. Полученные конъюгаты флуоресцентных наночастиц с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов устойчивы при хранении и в условиях проведения экспериментов с рецепторами и клетками,  обеспечивают высоко специфическое связывание с холинорецепторами и рецепторами Trk А, соответственно и, таким образом сохраняют высокий уровень биологической активности исходных белков. Исследована цитотоксичность полученных конъюгатов с использованием культур клеток млекопитающих. Показано, что токсичность конъюгатов проявляется при концентрациях, превышающих концентрации, необходимые для связывания с рецепторами. Таким образом, в результате выполнения проекта получены конъюгаты токсинов змеиных ядов с флуоресцентными нанокристаллами, которые обеспечивают окрашивание клеток и тканей, видимое с использованием флуоресцентного микроскопа, что позволяет проводить визуализацию никотиновых холинорецепторов и рецепторов Trk A для идентификации их распределения в клетках и тканях ex vivo.

В результате выполнения проекта разработаны методики синтеза флуоресцентных наночастиц, их функционализации биосовместимым трипептидом и конъюгации токсинов с флуоресцентными наночастицами. Эти методики могут быть использованы для приготовления флуоресцентно меченых белков, ковалентно конъюгированных с квантовыми точками. Альфа-нейротоксины, конъюгированные с флуоресцентными наночастицами и сохранившие при этом высокое сродство и избирательность взаимодействия с определенными подтипами никотиновых холинорецепторов, могут быть использованы для детектирования распределение этих рецепторов в тканях в норме и при патологиях, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания. Аналогичным образом конъюгаты фактора роста нервов, взаимодействующего с Trk A рецептором, могут применяться для мечения этих рецепторов. Токсины, конъюгированные с наночастицами другой природы, могут быть использованы в перспективе для адресной доставки в клетки лекарственных веществ, т.е. для создания лекарственных средств нового поколения.