Регистрация / Вход
Прислать материал

14.584.21.0006

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.584.21.0006
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"
Название доклада
Использование токсинов змеиных ядов, меченных функциональными наночастицами, для обнаружения эндогенных мишеней в клетках и тканях ex vivo с перспективой разработки новых диагностических и терапевтических средств.
Докладчик
Уткин Юрий Николаевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целями проекта являются создание и отработка методик получения конъюгатов квантовых точек - полупроводниковых функционализированных флуоресцентных наночастиц - с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов из ядов змей. Кроме того, в рамках проекта проводится разработка методов их применения в качестве маркеров соответствующих рецепторов в клетках и тканях. Полученные конъюгаты токсинов с флуоресцентными наночастицами в дальнейшем могут быть использованы в научных исследованиях, медицине и для создания тест систем, они также могут применяться для выявления особенностей строения и распределения рецепторов в тканях в норме и при патологиях, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания.
Актуальность и новизна исследования
Одной из основных задач современной биотехнологии является развитие сверхчувствительных и высокопроизводительных методов быстрого детектирования белков, генов и клеток. Возможность быстрого определения большого числа биологических молекул с чувствительностью на уровне единичных молекул необходима для дальнейшего развития таких областей, как медицинская диагностика и разработка новых лекарств. Перспективными в этом отношении являются полупроводниковые нанокристаллы, обеспечивающие очень яркий сигнал и обладающие высокой фотостабильностью. Применение полупроводниковых нанокристаллов может существенно расширить возможности визуализации многих биологических процессов. Использование нанокристаллов может стать основой новых неразрушающих методов визуализации рецепторных молекул и маркеров заболеваний. Разработка и применение конъюгатов полупроводниковых нанокристаллов является одной из задач, решаемых в данной работе. Получаемые конъюгаты предназначены для визуализации биологических процессов, протекающих в клетках, включая идентификацию трансформированных клеток. Картирование распределения маркеров опухоли, проводимое в формате клинического теста, представляет собой шаг к медицине будущего, а появление технологии точной оптической локализации лекарственных препаратов может существенно облегчить разработку лекарств новых поколений.
Описание исследования

В ходе выполнения данного исследования был использован целый ряд современных методов и методик. Так, для синтеза флуоресцентных наночастиц (квантовых точек, полупроводниковых нанокристаллов) сульфида цинка и селенида кадмия CdSe использовался коллоидный метод. Синтез проводили при комнатной температуре (295 K). Коллоидный метод позволяет получать квантовые точки, как в виде простых ядер, так и ядер с оболочками, обеспечивающими водорастворимость, биосовместимость и долгосрочную стабильность свойств. Наночастицы CdSe покрыты оболочкой сульфида цинка как полупроводника с достаточно широкой запрещенной зоной. Синтезированные в данной работе наночастицы типа ядро/оболочка CdSe/ZnS исследованы с использованием различных методов – оптической и флуоресцентной спектроскопии, методом лазерного динамического рассеяния, электронной просвечивающей микроскопии, анализа дзета-потенциала.

Выделение альфа-нейротоксинов и фактора роста нервов из ядов для получения их конъюгатов с флуоресцентными наночастицами проведено с применением современных видов классической и высокоэффективной жидкостной хроматографии, их структура охарактеризована методами масс-спектрометрии и белковой химии. Конъюгаты квантовых точек с токсинами синтезированы с использованием разработанных в данной работе и основанных на имеющихся в современной научной литературе методик, которые обеспечивают стабильность полученных конъюгатов как при хранении, так и при проведении исследований в физиологических условиях. Стабильность полученных конъюгатов обеспечена модификацией поверхности флуоресцентных наночастиц из CdSe в оболочке из ZnS тиол-содержащим трипептидом глутатионом. Эта же модификация обеспечивает биосовместимость конъюгатов. Для обеспечения ковалентного связывания функционализированных полупроводниковых наночастиц с токсинами использован метод создания амидной связи путем активации карбоксильных групп водорастворимым карбодиимидом. Разработанная методика ковалентной конъюгации поверхностно модифицированных флуоресцентных нанокристаллов с полипептидами может применяться для синтеза конъюгатов различных белков и пептидов с поверхностно модифицированными наночастицами разных типов.

Биологическую активность полученных конъюгатов исследовали с применением методов флуоресцентной микроскопии и радиолигандного анализа. В качестве источников рецепторов альфа-нейротоксинов и нейротрофинов использовали мембранные препараты никотиновых холинорецепторов, в частности, из электрического органа ската Torpedo californica, а также клеточные линии, экспрессирующие высокий уровень рецепторов Trk A, в частности, клеточную линию РС12 феохромоцитомы крысы.

Результаты исследования

В результате выполнения проекта разработаны методики и осуществлен синтез флуоресцентных наночастиц с различными оптическими характеристиками. Так, проведен синтез полупроводниковых флуоресцентных наночастиц со средним размером менее 20 нм и выделены из ядов токсины с чистотой не ниже 95%. Спектр флуоресценции полупроводниковых нанокристалов находится в диапазоне от ~ 500 нм до 670 нм в зависимости от размера наночастиц. Проведено сравнительное исследование методов фунционализации поверхности флуоресцентных наночастиц и выполнена их поверхностная модификация с использованием различных реагентов. Разработаны методики и осуществлена конъюгация флуоресцентных наночастиц с токсинами, разработаны методы очистки конъюгатов. Разработанные методы конъюгации обеспечивают ковалентное связывание альфа-нейротоксинов и фактора роста нервов с наночастицами. Полученные конъюгаты флуоресцентных наночастиц с альфа-нейротоксинами и фактором роста нервов устойчивы при хранении и в условиях проведения экспериментов с рецепторами и клетками,  обеспечивают высоко специфическое связывание с холинорецепторами и рецепторами Trk А, соответственно и, таким образом сохраняют высокий уровень биологической активности исходных белков. Исследована цитотоксичность полученных конъюгатов с использованием культур клеток млекопитающих. Показано, что токсичность конъюгатов проявляется при концентрациях, превышающих концентрации, необходимые для связывания с рецепторами. Таким образом, в результате выполнения проекта получены конъюгаты токсинов змеиных ядов с флуоресцентными нанокристаллами, которые обеспечивают окрашивание клеток и тканей, видимое с использованием флуоресцентного микроскопа, что позволяет проводить визуализацию никотиновых холинорецепторов и рецепторов Trk A для идентификации их распределения в клетках и тканях ex vivo.

Практическая значимость исследования
В результате выполнения проекта разработаны методики синтеза флуоресцентных наночастиц, их функционализации биосовместимым трипептидом и конъюгации токсинов с флуоресцентными наночастицами. Эти методики могут быть использованы для приготовления флуоресцентно меченых белков, ковалентно конъюгированных с квантовыми точками. Альфа-нейротоксины, конъюгированные с флуоресцентными наночастицами и сохранившие при этом высокое сродство и избирательность взаимодействия с определенными подтипами никотиновых холинорецепторов, могут быть использованы для детектирования распределение этих рецепторов в тканях в норме и при патологиях, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания. Аналогичным образом конъюгаты фактора роста нервов, взаимодействующего с Trk A рецептором, могут применяться для мечения этих рецепторов. Токсины, конъюгированные с наночастицами другой природы, могут быть использованы в перспективе для адресной доставки в клетки лекарственных веществ, т.е. для создания лекарственных средств нового поколения.