14.604.21.0150

В исследования было включено 200 пациентов: 100 человек с болезнью Паркинсона и 100 человек группы контроля без неврологической патологии. У всех больных был собран анамнез заболевания и анамнез жизни, проведень физикальный осмотр и набран биоматериал - фекалии. Сбор, пробоподготовка и хранение биоматериала проводились по методикам, разработанным в рамках реализации проекта. Для всех образцов биоматериала проводился контроль качества в соответствие с разработанной в рамках реализации проекта методикой. Выделение тотальной бактериальной ДНК проводилось в соответствие с разработанной методикой. Подготовка библиотек и ампликонное секвенирование маркерного вариабельного участка V3-V4 бактериальных генов 16S рРНК проводилось на приборе MiSeq (Illumina) согласно стандартному протоколу производителя. Фильтрация прочтений по качеству и их таксономическая классификация были проведены с помощью программного обеспечения QIIME версии 1.9.0. Для более точного определения таксономической принадлежности прочтений использовался подход, включающий в себя использование двух таксономических баз данных. На первом этапе командой pick_rep_set.py осуществлялся подбор референсного набора операционных таксономических единиц бактерий (ОТЕ) на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 . На втором этапе командой assign_taxonomy.py с использованием алгоритма RDP проводилось определение таксономической принадлежности данных ОТЕ на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb, которая содержит информацию о связи ОТЕ с ближайшими культивируемыми видами. Такой подход позволил осуществить более точную таксономическую классификацию микробиоты с одной стороны, и сохранил возможность предсказания функциональной активности метагеномов больных, с другой стороны. Оценка α- и β-разнообразия проводилась с использованием программного обеспечения QIIME. Для оценки α-разнообразия проводилось прореживание образцов до уровня образца с минимальной представленностью ОТЕ (2000 ОТЕ/образец) с последующим подсчетом таксономических индексов разнообразия chao1, Shannon, PD whole tree и observed OTUs в исследуемых группах и сравнением индексов с использованием непараметрического t-теста, результат представлен в виде средних значений ± стандартное отклонение. Оценка β-разнообразия проводилась с использованием анализа главных координат (PCoA) при расчете метрики weighted Unifrac и нормализации данных с использованием алгоритма CSS. Для определения достоверности попарного различия сообществ по составу микробиоты и вклада исследуемых заболеваний в данное различие использовался метод ANOSIM (ANalysis Of SIMilarity, рус. анализ общности), Adonis и MRPP (Multi-response permutation procedure, рус. метод перестановки с анализом множественного отклика) с оценкой достоверности при 9999 перестановках. Для определения различий в таксономической и функциональной композиции микробиоты микроорганизмы с низкой представленностью – присутствовавшие менее чем в 20 образцах исключались, после чего проводилась нормализация данных с использованием алгоритма CSS. Для получения таксономических профилей микробиоты ОТЕ агрегировали на уровне типов, родов и видов. Те операционные таксономические единицы, для которых в качестве видового наименования в базе HITdb было приведено название ближайшего культивируемого вида, считались бактериями данного вида. Определение различий в представленности ОТЕ проводилось с использованием специализированной статистической модели fitFeatureModel пакета metagenomeSeq языка R при поправке на множественные сравнения по методу Бенджамини-Хохберга; различия считались достоверными при значении p 0.05 и менее после применения поправки. ОТЕ бактерий по которым были обнаружены различия в представленностями затем использовались для обучения классифицирующей модели, основанной на применении логистической регрессии. Чуствительность и специфичность модели оценивалась с помощью ROC-анализа. На основе применения обученной регрессионной модели был создан алгоритм ранней диагностики болезни Паркинсона, реализованный в виде программного обеспечения.

Создана коллекция образцов микробиоты кала, которую составили 100 образцов от пациентов с болезнью Паркинсона и 100 образцов от лиц группы контроля. Для стандартизации полученного биологического материала разработана методика оценки качества образцов биологического материала, содержащего метагеномные сообщества кала. Проведен анализ научной литературы и методических рекомендаций касательно методов оценки качества образцов микробиоты, отобраны и сравнены наиболее подходящие методики, на основе которых разработана методика контроля качества. Для оценки качества коллекции микробиоты проведено исследование всех образцов из коллекции и проведена выбраковка не прошедших контроль качества образцов. Сформирована коллекция образцов кала для генетического профилирования, составляющая 200 образцов. Проведено секвенирование микробиоты кишечника по маркерным генам 16S рРНК и проведен биоинформатический анализ таксономических профилей микробиоты пациентов контрольной группы и лиц с болезнью Паркинсона. При оценке α-разнообразия было установлено, что микробиота кишечника при болезни Паркиснона характеризуется снижением таксономического богатства, что может свидетельствовать о протекании воспалительных процессов в кишечнике при данном заболевании. При оценке β-разнообразия установлены попарные различия в составе микробиоты лиц с болезнью Паркинсона и контрольной группы. В результате проведенного статистического исследования были получены различия в таксономической композиции микробиоты на всех уровнях: от типа до вида, а также различия в представленности отдельных ОТЕ. Так на уровне типа микробиота кишечника при болезни Паркинсона характеризовалась более выраженной представленностью археев, протеобактерий и актинобактерий и снижением количества типа Bacteroidetes. На уровне класса пациенты с болезнью Паркинсона характеризовались преобладанием актинобактерий, бацилл, метанобактерий и гамма- и дельтапротеобактерий и снижением Bacteroidia. На уровне отрядов наиболее выражены различия в представленности Enterobacteriales, Lactobacillales и Bifidobacteriales - повышены у лиц с болезнью Паркинсона, и Bacteroidales - повышены у пациентов контрольной группы. На уровне семейств микробиота пациентов с болезнью Паркинсона характеризовалась увеличением представленности Christensenellaceae, Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Bifidobacteriaceae и Clostridiaceae, и снижением Lachnospiraceae, Bacteroidaceae и Prevotellaceae (приведены наиболее выраженные различия). Схожий тренд определялся на родовом и видовом уровне. Так, микробиота пациентов с болезнью Паркинсона отличалась повышением представленности родов Lactobacillus, Christensenella, Oscillospira, Bifidobacterium, Catabacter и видов Christensenella minuta, Ruminococcus bromii, Catabacter hongkongensis, и снижением представленности родов Dorea, Bacteroides, Prevotella и видов Bacteroides dorei, Dorea longicatena, Prevotella copri (приведены наиболее выраженные различия). Различия в бактериальном составе микробиоты оказались схожие с таковыми в исследованиях, проведенных на американской и финской популяции, что подтверждает достоверность найденных различий и применимость микробиотных биомаркеров для диагностики болезни Пакринсона. Разработанная логистическая модель для программного обеспечения обладала следующими характеристиками: чувствительность 98,9%, специфичность 98,5%, AUC 0,995.