Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0150

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0150
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Выявление биомаркеров микробиотического сообщества кишечника для ранней, доклинической диагностики болезни Паркинсона
Докладчик
Алифирова Валентина Михайловна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели: исследовать состав микробиотического сообщества кишечника с целью выявления биомаркеров для разработки доклинической диагностики болезни Паркинсона; создать алгоритм доклинической диагностики болезни Паркинсона с использованием перечня биомаркеров микробиотического сообщества кишечника.
Задачи: набор биологического материала; выделение ДНК из биологического материала; получение полногеномных метагеномных профилей микробиоты кишечника методом NGS-секвенирования; биоинформационный анализ полногеномных метагеномных профилей микробиоты кишечника; поиск ассоциации между составом микробиоты кишечника и наличием БП; разработка способа доклинической диагностики болезни Паркинсона с использованием биомаркеров микробиотического сообщества кишечника; разработка алгоритма доклинической диагностики болезни Паркинсона с использованием биомаркеров микробиотического сообщества кишечника.
Актуальность и новизна исследования
Болезнь Паркинсона – одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний. На настоящий момент, благодаря улучшению качества и доступности медицинской помощи, в развитых странах доля населения пожилого и старческого возраста растет. Болезнь Паркинсона чаще всего поражает людей старше 50 лет и поэтому сейчас наблюдается неуклонный рост числа больных ею. Так, в 2004 году число больных болезнью Паркинсона составляло 4 миллиона человек по всему миру, теперь же их насчитывается около 10 миллионов. Это заболевание радикально неизлечимо и неврологический дефицит, полученный в результате процессов нейродегенерации полностью устранить невозможно. Нейродегенерация при болезни Паркинсона начинается за 10-15 до клинического дебюта и одними из первых поражаются нейроны периферической нервной системы, в частности кишечника. При поражения нервного аппарата кишки происходит нарушение ее работы, что приводит изменению состава сообщества кишечных бактерий – микробиоты. На данный момент установлено, что при болезни Паркинсона происходит изменение состава микробиоты кишечника, что может послужить возможным триггером, запускающим нарушение фолдинга белка альфа-синуклеина, входящего в состав телец Леви, запускающих нейродегенерацию. В этой связи, характеристика микробиоты при болезни Паркинсона и поиск микробиотических биомаркеров для ее ранней диагностики является важной задачей, решение которой позволит начинать специфическую терапию болезни еще до клинического дебюта, сохранив качество жизни больных.
Описание исследования

В исследования было включено 200 пациентов: 100 человек с болезнью Паркинсона и 100 человек группы контроля без неврологической патологии. У всех больных был собран анамнез заболевания и анамнез жизни, проведень физикальный осмотр и набран биоматериал - фекалии. Сбор, пробоподготовка и хранение биоматериала проводились по методикам, разработанным в рамках реализации проекта. Для всех образцов биоматериала проводился контроль качества в соответствие с разработанной в рамках реализации проекта методикой. Выделение тотальной бактериальной ДНК проводилось в соответствие с разработанной методикой. Подготовка библиотек и ампликонное секвенирование маркерного вариабельного участка V3-V4 бактериальных генов 16S рРНК проводилось на приборе MiSeq (Illumina) согласно стандартному протоколу производителя. Фильтрация прочтений по качеству и их таксономическая классификация были проведены с помощью программного обеспечения QIIME версии 1.9.0. Для более точного определения таксономической принадлежности прочтений использовался подход, включающий в себя использование двух таксономических баз данных. На первом этапе командой pick_rep_set.py осуществлялся подбор референсного набора операционных таксономических единиц бактерий (ОТЕ) на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 . На втором этапе командой assign_taxonomy.py с использованием алгоритма RDP проводилось определение таксономической принадлежности данных ОТЕ на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb, которая содержит информацию о связи ОТЕ с ближайшими культивируемыми видами. Такой подход позволил осуществить более точную таксономическую классификацию микробиоты с одной стороны, и сохранил возможность предсказания функциональной активности метагеномов больных, с другой стороны. Оценка α- и β-разнообразия проводилась с использованием программного обеспечения QIIME. Для оценки α-разнообразия проводилось прореживание образцов до уровня образца с минимальной представленностью ОТЕ (2000 ОТЕ/образец) с последующим подсчетом таксономических индексов разнообразия chao1, Shannon, PD whole tree и observed OTUs в исследуемых группах и сравнением индексов с использованием непараметрического t-теста, результат представлен в виде средних значений ± стандартное отклонение. Оценка β-разнообразия проводилась с использованием анализа главных координат (PCoA) при расчете метрики weighted Unifrac и нормализации данных с использованием алгоритма CSS. Для определения достоверности попарного различия сообществ по составу микробиоты и вклада исследуемых заболеваний в данное различие использовался метод ANOSIM (ANalysis Of SIMilarity, рус. анализ общности), Adonis и MRPP (Multi-response permutation procedure, рус. метод перестановки с анализом множественного отклика) с оценкой достоверности при 9999 перестановках. Для определения различий в таксономической и функциональной композиции микробиоты микроорганизмы с низкой представленностью – присутствовавшие менее чем в 20 образцах исключались, после чего проводилась нормализация данных с использованием алгоритма CSS. Для получения таксономических профилей микробиоты ОТЕ агрегировали на уровне типов, родов и видов. Те операционные таксономические единицы, для которых в качестве видового наименования в базе HITdb было приведено название ближайшего культивируемого вида, считались бактериями данного вида. Определение различий в представленности ОТЕ проводилось с использованием специализированной статистической модели fitFeatureModel пакета metagenomeSeq языка R при поправке на множественные сравнения по методу Бенджамини-Хохберга; различия считались достоверными при значении p 0.05 и менее после применения поправки. ОТЕ бактерий по которым были обнаружены различия в представленностями затем использовались для обучения классифицирующей модели, основанной на применении логистической регрессии. Чуствительность и специфичность модели оценивалась с помощью ROC-анализа. На основе применения обученной регрессионной модели был создан алгоритм ранней диагностики болезни Паркинсона, реализованный в виде программного обеспечения.

Результаты исследования

Создана коллекция образцов микробиоты кала, которую составили 100 образцов от пациентов с болезнью Паркинсона и 100 образцов от лиц группы контроля. Для стандартизации полученного биологического материала разработана методика оценки качества образцов биологического материала, содержащего метагеномные сообщества кала. Проведен анализ научной литературы и методических рекомендаций касательно методов оценки качества образцов микробиоты, отобраны и сравнены наиболее подходящие методики, на основе которых разработана методика контроля качества. Для оценки качества коллекции микробиоты проведено исследование всех образцов из коллекции и проведена выбраковка не прошедших контроль качества образцов. Сформирована коллекция образцов кала для генетического профилирования, составляющая 200 образцов. Проведено секвенирование микробиоты кишечника по маркерным генам 16S рРНК и проведен биоинформатический анализ таксономических профилей микробиоты пациентов контрольной группы и лиц с болезнью Паркинсона. При оценке α-разнообразия было установлено, что микробиота кишечника при болезни Паркиснона характеризуется снижением таксономического богатства, что может свидетельствовать о протекании воспалительных процессов в кишечнике при данном заболевании. При оценке β-разнообразия установлены попарные различия в составе микробиоты лиц с болезнью Паркинсона и контрольной группы. В результате проведенного статистического исследования были получены различия в таксономической композиции микробиоты на всех уровнях: от типа до вида, а также различия в представленности отдельных ОТЕ. Так на уровне типа микробиота кишечника при болезни Паркинсона характеризовалась более выраженной представленностью археев, протеобактерий и актинобактерий и снижением количества типа Bacteroidetes. На уровне класса пациенты с болезнью Паркинсона характеризовались преобладанием актинобактерий, бацилл, метанобактерий и гамма- и дельтапротеобактерий и снижением Bacteroidia. На уровне отрядов наиболее выражены различия в представленности Enterobacteriales, Lactobacillales и Bifidobacteriales - повышены у лиц с болезнью Паркинсона, и Bacteroidales - повышены у пациентов контрольной группы. На уровне семейств микробиота пациентов с болезнью Паркинсона характеризовалась увеличением представленности Christensenellaceae, Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Bifidobacteriaceae и Clostridiaceae, и снижением Lachnospiraceae, Bacteroidaceae и Prevotellaceae (приведены наиболее выраженные различия). Схожий тренд определялся на родовом и видовом уровне. Так, микробиота пациентов с болезнью Паркинсона отличалась повышением представленности родов Lactobacillus, Christensenella, Oscillospira, Bifidobacterium, Catabacter и видов Christensenella minuta, Ruminococcus bromii, Catabacter hongkongensis, и снижением представленности родов Dorea, Bacteroides, Prevotella и видов Bacteroides dorei, Dorea longicatena, Prevotella copri (приведены наиболее выраженные различия). Различия в бактериальном составе микробиоты оказались схожие с таковыми в исследованиях, проведенных на американской и финской популяции, что подтверждает достоверность найденных различий и применимость микробиотных биомаркеров для диагностики болезни Пакринсона. Разработанная логистическая модель для программного обеспечения обладала следующими характеристиками: чувствительность 98,9%, специфичность 98,5%, AUC 0,995.

Практическая значимость исследования
Исследуемые биомаркеры будут предназначены для доклинической диагностики болезни Паркинсона. На их основе, в дальнейшем, возможно создание диагностических тест-систем для определения вероятности развития болезни Паркинсона до первых клинических проявлений. Применение полученных результатов возможно в научно-клинических учреждениях здравоохранения, специализированных лечебно-профилактических учреждениях, учреждениях высшего профессионального образования и науки.
Постер

Poster_14604210150.ppt