Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0054

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0054
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук
Название доклада
Изучение механизма нейротоксичности альфа синуклеина при болезни Паркинсона. Роль митохондрий, ионов кальция и окислительного стресса.
Докладчик
Бережнов Алексей Валерьевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель: Выяснение механизмов токсичности альфа-синуклеина и эффектов этого пептида на основные клеточные мишени при болезни Паркинсона (БП) – митохондрии, Са2+-сигнализацию и на продукцию активных форм кислорода (АФК) нейронами и астроцитами, а также разработка новых способов защиты клеток мозга от токсического действия альфа-синуклеина (а-син).
Задачи:
1. Сравнить нейротоксическое действие мономерной, олигомерной и фибриллярной форм а-син;
2. Исследование роли Са2+-сигнализации в развитии токсических эффектов а-син;
3. Исследование эффектов а-син на митохондриальную функцию, продукцию АФК и вовлечение этих эффектов в развитие нейротоксичности а-син;
4. Разработать новый подход для защиты нейронов от токсичности а-син, основанный на восстановлении нормальной физиологии митохондрий, Са2+-сигнализации и регуляции продукции активных форм кислорода, в том числе с использованием активаторов Nrf2.
Актуальность и новизна исследования
Болезнь Паркинсона (БП) является прогрессирующим, неизлечимым нейродегенеративным заболеванием, которым страдает приблизительно 1% населения старше 65 лет. Это второе по распространенности нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера (Hirtz соавт., 2007). В России по разным оценкам число больных БП варьирует от 117 до 338 тыс. Исследование, проведенное в Германии (Winter et al., 2010), оценило затраты на пациента в год в сумму в 20096€. Учитывая старание населения всего мира, это наносит серьезный материальный ущерб для общества в целом.
Признаками БП являются появление тремора, брадикинезии и ригидности, нарушение рефлексов и акинезия (Lees et al., 2009). Существующие способы лечения не эффективны и носят симптоматический характер и основаны на восполнении уровня дофамина его предшественниками. Много данных было получено о патогенезе БП, однако большое количество проблем, связанных с развитием БП еще не решены. В настоящее время представлены убедительные доказательства того, что избыток альфа-синуклеина (а-син) является универсальным определяющим фактором в патогенезе БП. При этом клеточный механизм нейродегенерации, индуцированный а-син остается неясным. Выявление путей реализации токсического действия различных форм а-син позволит значительно расширить понимание патогенетических механизмов БП, даст возможность создать новые терапевтические стратегии, подразумевающие остановку или хотя бы замедление развития заболевания, а не только симптоматическое лечение.
Описание исследования

На клеточных культурах – нейронах мозга крысы (среднего мозга), человеческих нейронах, полученных из клеток iPS или hES с высоким и низким уровнем экспрессии а-син с применением методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии будет показано, что экзогенный (а также эндогенный) олигомерный, но не мономерный, а-син нарушает кальциевый гомеостаз клеток, в частности, за счет формирования ионопроницаемой поры в плазмалемме, а также путем нарушения нормального функционирования основных путей кальциевой сигнализации (PLC-IP3 и cAMP-PKA). Будет показано, что кальциевая перегрузка нейронов под действием а-син предотвращается в присутствии активаторов Nrf2. Будет количественно охарактеризовано влияние а-син на кальциевый гомеостаз и биоэнергетику митохондрий нейронов. Будет показано, что увеличение концентрации альфа-синуклеина (мономера или олигомера) способствует деэнергизации митохондрий, вызывает кальциевую перегрузку и открытие неспецифической митохондриальной поры. При этом использование флуоресцентно-меченых олигомеров а-син позволит понять как они влияют на сигнализацию кальция в нейронах и астроцитах, за счет визуализации локализации олигомеров на или в клетках и одновременного измерения внутриклеточного кальция. Будет показана гиперактивация продукции активных форм кислорода (АФК) в нейронах при действии олигомерного а-син. Будут определены сигнальные пути, приводящие к такой активации продукции АФК. Будет определено какая доза олигомера и длина цепи олигомера необходима для реализации этого эффекта и как активность путей активации продукции АФК изменяется в присутствии избытка эндогенного а-син. Будет показано нейротоксическое влияние кратковременной и долговременной инкубации с синуклеином. При этом с учетом полученных данных по влиянию а-син на кальциевый гомеостаз, продукцию АФК и биоэнергетику митохондрий, будет разработан новый подход для защиты клеток, подвергнутых токсическому действию а-син. Новый подход будет основан на стимуляции антиосидантной системы клеток путем активации экспрессии фактора транскрипции Nrf2, а также предотвращения нейротоксического действия а-син путем восстановления кальциевой сигнализации, митохондриальной функции и концентрации эндогенных АФК путем воздействия на соответствующие сигнальные каскады.

Результаты исследования

Разработана методика получения клеточной модели нейронов мозга крысы, позволяющей оценивать влияние мономерного, олигомерного и фибриллярного а-син на кальциевую сигнализацию, митохондрии и продукцию АФК клетками. Иностранным партнером разработана методика получения человеческих нейронов, дифференцированных из фибробластов и плюрипотентных клеток пациентов с болезнью Паркинсона и их здоровых родственников. С использованием вышеуказанных объектов исследования нами показано, что экзогенный олигомерный, но не мономерный, а-син нарушает кальциевый гомеостаз клеток, вызывая кальциевые сигналы в клетках мозга, по-видимому, за счет формирования ионопроницаемой поры в плазмалемме. Эффект зависит от внеклеточного кальция. Кроме того, добавление олигомерного а-син приводит к активации каспаз и индукции апоптоза в течение 15 минут с последующей гибелью клеток мозга.

При измерении уровня митохонриального потенциала было показано, что олигомерный и мутантный мономерный (А53Т) а-син, но не мономерный а-син дикого типа или мутантные формы А30Р, Е46К, вызывает деполяризацию митохондрий и оверпродукцию АФК клетками мозга. При этом показано, что данный эффект чувствителен к присутствию циклоспорина А, что свидетельствует об индукции митохондриальной неспецифической поры альфа-синуклеином. Эффект а-син на митохондриальный мембранный потенциал блокируется избытком субстратов – пируватом и диметилсукцинатом. Также показано, что мономерный а-син (А53Т) блокирует I комплект электрон-транспортной цепи митохонрий, что выражается в росте аутофлуоресценции NADH. Мономерный а-син (А53Т) в концентрациях 200-300 нМ проявляет нейротоксические свойства, что выражается в увеличении погибших клеток в культуре уже через 24 часа после добавления а-син.

Таким образом, показано, что а-син способен вызывать нарушения клеточного гомеостаза, общим в действии олиго-а-син и моно-а-син является активация оверпродукции АФК в митохондриях и индукция клеточной гибели нейронов и глиальных клеток.

В эксперименте нами показано, что активация эндогенных антиоксидантных систем через активацию фактора Nrf2 обладает выраженным нейропротекторным действием, причем среди протестированных воздействий наиболее эффективно действие активатора Nrf2 – RTA-408 в концентрации 40 нМ.

Полученные данные дают экспериментальное обоснование для создания нового подхода, который должен быть основан на стимуляции антиоксидантной системы клеток путем активации экспрессии фактора транскрипции Nrf2.

Практическая значимость исследования
Результаты работ по данному проекту в перспективе направлены на помощь пациентам с болезнью Паркинсона, поскольку будет получена принципиально новая информация о мишенях, воздействие на которые поможет предотвратить развитие нейродегенерации. Исследование представляет собой уникальную возможность понять роль а-син в физиологии и патологии клеток мозга, что поможет нам значительно улучшить понимание клеточных механизмов нейродегенерации при БП. Данные, которые будут получены по результатам проекта, могут быть использованы как основа для развития новой стратегии для лечения БП. Кроме того, проект также ориентирован на то, чтобы сделать экспериментальные результаты данного исследования, также как и разработанные новые подходы, достоянием научной общественности путем публикации в ведущих рецензируемых научных журналах.