Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0049

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0049
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Выявление перспективных молекулярных мишеней для терапии гепатоцеллюлярной карциномы на основе системно-биологического анализа транскриптомных данных, полученных методом NGS.
Докладчик
Мюге Николай Сергеевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является разработка программного обеспечения для построения транскрипционных функциональных карт, отражающих изменения молекулярного профиля клеток при онкогенезе и выявление с помощью данного ПО новых молекулярных мишеней для противоопухолевой терапии гепатоцеллюлярной карциномы (ГК).
Были поставлены следующие задачи:
1. Разработать алгоритм анализа транскрипционных данных, а именно метод выявления ключевых регуляторов экспрессии генов, вовлеченных в патогенез ГК.
2. Разработать алгоритмы и методику визуализации транскрипционных функциональных карт - интегральной информации об активности выявленных регуляторов экспрессии (молекулярных мишеней).
3. Разработать алгоритмы построения, анализа и визуализации молекулярных путей в норме и при ГК и реализовать разработанные алгоритмы в виде программного обеспечения.
4. Используя разработанное программное обеспечение, провести анализ по выявлению перспективных молекулярных мишеней, на имеющихся в открытом доступе данных по экспрессии генов при ГК
5. Сформировать банк образцов ГК (не менее 50 случаев), включающий парные образцы нормальной и опухолевой ткани печени одного и того же пациента. Провести транскриптомное профилирование парных образцов опухолевых и нормальных тканей, используя технологии RNAseq.
6. На основании полученных экспериментальных данных выявить ключевые регуляторы экспрессии (молекулярные мишени).
7. Провести экспериментальную валидацию перспективных молекулярных мишеней для противоопухолевой терапии гепатоцеллюлярной карциномы с помощью технологий нокдауна и/или с применением специфических ингибиторов их активности на клеточных культурах гепатокарциномы человека.
Актуальность и новизна исследования
В настоящем проекте предлагается разработать и апробировать новый подход к идентификации молекулярных мишеней для терапии онкологических заболеваний на примере одной из наиболее агрессивных форм опухолей – гепатоцеллюлярной карциномы (ГК). ГК – самая часто встречающаяся опухоль печени и одна из наиболее распространенных форм рака в мире. ГК характеризуется быстро прогрессирующим течением с неблагоприятным прогнозом, нечувствительностью к стандартным схемам химиотерапии и занимает третье место в мире по уровню смертности от онкологических заболеваний. Клинические исследования демонстрируют высокую гетерогенность пациентов с ГК по выявляемым молекулярным сигнатурам. Согласно базе данных COSMIC выявлены нарушения в 1922 генах, причем мутации только в 4 генах (TP53, CTNNB1, AXIN1 и ARID1A) встречаются более чем 10% случаев ГК. Такая гетерогенность подразумевает существование множества различных драйверных механизмов гепатоканцерогенеза, а следовательно и дополнительно стимулирует необходимость выявления новых молекулярных мишеней для проведения стратифицированной терапии. К настоящему времени молекулярные механизмы возникновения и прогрессии ГК изучены недостаточно. Препаратом выбора для лечения ГК является мультикиназный ингибитор сорафениб, который в 2007 г. был одобрен European commission и FDA для лечения неоперабельной ГК. Хотя использование сорафениба у части пациентов приводило к сдерживанию роста ГК и снижению метастатического потенциала опухолевых клеток (в среднем увеличение продолжительности жизни составляло 2-3 месяца), приходится признать, что на сегодняшний день эффективной лекарственной терапии ГК не существует.
Описание исследования

Для исследования изменений экспрессии генов в опухолевых тканях пациентов по сравнению с неопухолевой тканью печени было проведено высокопроизводительное параллельное секвенирование транскриптома (RNA-Seq) 50 случаев ГК с целью качественного и количественного анализа транскриптов и выявления генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальной и опухолевой ткани.

Разработка программного обеспечения для поиска молекулярных мишеней проводилась с использованием анализа имеющихся в открытом доступе данных по дифференциальной экспрессии в образцах ГК и неопухолевой ткани печени (более 200 случаев), полученных как методом RNA-Seq, так и гибридизацией на микрочипах.

Для поиска молекулярных путей патогенеза при гепатоцеллюлярной карциноме предложен алгоритм, использующий в качестве опорных узлов сети молекулярных взаимодействий выявленные для изучаемого патологического состояния гены-регуляторы. Молекулярные пути, проходящие через найденные гены-регуляторы, могут быть причиной или быть ассоциированы с патологическим состоянием. Для учета накопленных знаний по регуляторным путям в клетке при поиске молекулярных путей патогенеза использовалась база данных сигнальных путей, созданная в рамках данного ПНИ. В указанной базе данных путей был проведен анализ перепредставленности (enrichment) множества генов-регуляторов, выявленных для рассматриваемого патологического состояния.

Полученный список мишеней, был верифицирован путем анализа данных полнотранскриптомного секвенирования 50 клинических случаев ГК, полученных при резекции опухолей в РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава России.

На основании полученных данных был проведен анализ наиболее значимых молекулярных механизмов (путей) патогенеза при гепатоцеллюлярной карциноме и поиск потенциальных молекулярных мишеней для действия противоопухолевых лекарственных препаратов.

Ряд перспективных потенциальных мишеней, выявленных в ходе анализа как публичных данных, так и полученных нами данных RNA-Seq, был отобраны для дальнейшей экспериментальной валидации исходя из системно-биологической значимости в регуляции клеточных процессов, возможности корректировки разрабатываемыми в настоящее время препаратами, а также исходя из возможности создания подходов для искусственной регуляции их активности на культурах клеток ГК человека (ингибирование, нокдаун) с целью верификации биологической значимости нарушения функциональной активности выявленных мишеней.

 

Результаты исследования

В ходе выполнения проекта нами были отобраны 50 гистологически подтвержденных клинических случаев ГК невирусной этиологии. Для каждого случая было взято по два образца опухолевой и два образца окружающей ткани печени, полученных при резекции опухоли, из которых была выделена тотальная РНК, подготовлены библиотеки и проведен анализ экспрессии на приборе Illumina2000 (RNA-Seq, всего 200 образцов).

Были разработаны метод выявления дифференциально экспрессирующихся генов и алгоритм анализа транскрипционных данных, основанный на выявлении регуляторов генной экспрессии, предложен метод построения транскрипционной функциональной карты. Разработано программное обеспечение для нахождения потенциальных мишеней, а также необходимые для анализа базы данных результатов транскрипционного анализа ГК человека из открытых источников, существующих противоопухолевых лекарственных препаратов и их молекулярных мишеней и коллекция тканеспецифичных сигнальных и метаболических каскадов, включающая генные сети процессов онкогенеза.

Анализ общедоступных баз данных позволил выявить 358 потенциальных мишеней, 341 из которых были валидированы при анализе данных транскриптомного секвенирования 50 клинических случаев ГК, проведенного исполнителями проекта. На основании этих данных были идентифицированы наиболее значимые процессы и молекулярные пути, потенциально ингибируемые новыми противоопухолевыми препаратами - апоптоз, клеточный цикл, эпителиально-мезенхимальный переход и клеточная подвижность, сигнальные каскады MAPK/ERK, PI3K/AKT/MTOR и неканонический WNT путь.

Для экспериментальной валидации полученных результатов на культурах клеток ГК человека было отобрано 10 потенциальных мишеней, относящихся к 3 наиболее перспективным с точки зрения разработки методов терапии функциональным классам - факторы роста и их рецепторы, компоненты внутриклеточных сигнальных путей, регулирующие передачу сигнала и транскрипционные факторы, осуществляющие непосредственную регуляцию экспрессии генов, контролирующих ключевые свойства опухолевых клеток, определяющие формирование злокачественного фенотипа - VEGFA, EGFR, TGFB, mTOR, ROCK1, E2F/Rb, HNF4A, NR1H3 (LXRA), IQGAP3, Rab3B.

Разработаны экспериментальные подходы для исследования подавления их функциональной активности с применением специфических ингибиторов для блокирования активности сигнальных путей или малых интерферирующих РНК для нокдауна конкретных генов-мишеней. С помощью разработанных инструментов исследовано влияние подавления активности выбранных мишеней на биологические свойства, являющиеся определяющими для приобретения клетками метастатических свойств – скорость пролиферации и миграционный потенциал.

Наиболее значительный блокирующий эффект на скорость роста культур клеток ГК человека (более, чем 10-кратное снижение уровня пролиферации) показан для высокоселективного ингибитора активности циклин-зависимых киназ CDK4 и CDK6 PD0332991 (Palbociclib), который блокирует E2F-pRb зависимую сигнализацию. Активация E2F-pRb сигнального пути является наиболее частым нарушением, выявленным как на общедоступной, так и на экспериментальной выборке образцов. Таким образом, разработка подходов к блокированию этого сигнального пути на уровне ингибирования образования комплексов циклина D1 с CDK4 и CDK6 представляется перспективным подходом для разработки методов эффективного подавления пролиферации опухолевых клеток.

Практическая значимость исследования
Разработанные алгоритмы анализа транскриптомных данных и программы для идентификации регуляторов генной экспрессии и выявления задействованных в злокачественной трансформации молекулярных путей могут быть использованы медицинскими, образовательными и научными учреждениями медико-биологического профиля, в том числе и для работ в области персонифицированной медицины. Современная мировая тенденция к созданию NGS-лабораторий и биоинформатических подразделений в онкологических центрах позволяет уверенно предсказать растущую востребованность разрабатываемых подходов.
Новые данные о нарушении транскрипционной программы опухолевых клеток и молекулярные мишени, выявленные в ходе выполнения проекта, могут быть использованы научными учреждениями и фармацевтическими компаниями для разработки новых подходов и препаратов для лечения онкологических заболеваний, а также расширения списка локализаций, для которых могут быть использованы таргетные препараты, ранее прошедшие клинические испытания для других форм опухолей. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть востребованы медицинскими учреждениями РФ как государственного подчинения, так и коммерческими медицинскими учреждениями и фармацевтическими компаниями, внедряющими инновационные подходы в области лечения онкологических заболеваний. Ряд данных, полученных в ходе выполнения проекта, включен в материалы курсов лекций «Биология опухолевой клетки» для студентов Биологического факультета и Факультета биоинжененрии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова