14.607.21.0050

Целью проекта является:
Разработка технологических основ экологически безопасного и энергоэффективного процесса ферментативной конверсии растительного сырья в технические сахара и эффективного способа микробиологического получения карбоновых кислот, как полупродуктов для химического синтеза биополимеров.
Задачами проекта являются:
- разработка набора методик, позволяющих провести адекватный анализ эффективности всех стадий процесса переработки исходного инулинсодержащего сырья в конечную продукцию- карбоновые кислоты, а также оценку пригодности получаемых органических кислот для производства биопластиков;
- разработка новых рекомбинантных штаммов и ферментных препаратов инулиназ, позволяющих эффективно гидролизовать инулинсодержащее сырье топинамбура в технические сахара;
- проведение экспериментальных исследований, отражающих процесс переработки инулинсодержащего сырья в карбоновые кислоты на лабораторном оборудовании;
- разработка технической документации (Лабораторных регламентов и Программ и методик испытаний) для получения и испытания экспериментальных образцов технических сахаров и карбоновых кислот;
- масштабирование разработанного процесса на пилотной установке на базе Индустриального партнера - ООО «Краснодарский биоцентр»
В качестве некрахмального растительного сырья в проекте используется биомасса топинамбура. Под карбоновыми кислотами подразумевается получение молочной и фумаровой кислот для их использования при получении биополимеров.

Наиболее перспективным возобновляемым источником органических молекул для биопереработки в России является биомасса растений и отходов её переработки. Основными источниками биомассы являются быстрорастущие многолетние растения, различные некрахмалосодержащие сельскохозяйственные культуры для получения технических сахаров, которые в дальнейшем могут быть конвертированы в разнообразные биопродукты. Особого внимания заслуживает высокоурожайное инулинсодержащее растение — топинамбур, который благодаря исключительному биохимическому составу, неприхотливости в условиях произрастания становиться одной из популярных сельскохозяйственных культур для использования в процессах ферментативной и микробиологической биоконверсии. Органические кислоты (в частности, фумаровая, янтарная и молочная) являются ценными полупродуктами для органического синтеза. В аналитическом отчете компании Frost & Sullivan «Стратегический анализ мирового рынка химической продукции на основе биологически возобновляемого сырья», фумаровая кислота (вместе с яблочной и янтарной) была определена в качестве одного из десяти основных химических веществ, которые могут быть получены из сахаров путем биологической или химической конверсии. Фумаровая кислота используется в производстве лекарств, напитков, продуктов питания, кормов для животных, моющих средств, ненасыщенных полиэфирных, алкидных смол, и печатных красок. В последнее время фумаровая кислота нашла еще одно очень важное применение - в качестве сырья для микробиологического получения янтарной кислоты, которая в свою очередь также представляет собой ценное сырье для химической промышленности, в частности, для получения биопластиков на ее основе.

   Объектом разработки является новая технологическая схема получения карбоновых кислот, в частности фумаровой и молочной кислоты, объединяющая два процесса- ферментативную конверсию некрахмального растительного сырья в простые сахара и микробиологическую трансформацию получаемых сахаров в карбоновые кислоты.

   Новизна разработки заключается в 1) анализе реакционной способности нескольких видов некрахмальной растительной биомассы, являющейся отходами деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства, 2) создании новой серии ферментных препаратов для деградации целлюлозо- и инулосодержащего сырья, 3) использовании модифицированных микроорганизмов в стадии биосинтеза карбоновых кислот, 4) анализе возможностей удешевления процесса переработки некрахмального сырья в карбоновые кислоты с применением ферментативных технологий.

  Для достижения целей проекта и решения поставленных задач были разработаны и/или модифицированы следующие методики:

- методика определения концентрации белка в ферментных препаратах;

- методика определения состава сахаров в ферментативных гидролизатах непищевого растительного сырья;

- методика определения инулиназной активности в ферментных препаратах;

- методика селективного отбора продуктивного штамма-продуцента фумаровой кислоты;

- методика селективного отбора продуктивного штамма-продуцента молочной кислоты;

- методика получения фумаровой кислоты на основе простых сахаров;

- методика получения молочной кислоты на основе простых сахаров.

 Для тестирования экспериментальных образцов были разработаны Программы и методики испытаний, в частности:

- ПМ испытаний новых ферментных препаратов для гидролиза предобработанного сырья на лабораторном оборудовании;

- ПМ испытаний экспериментальных образцов фумаровой кислоты в новых гидролизных средах ;

- ПМ испытаний экспериментальных образцов молочной кислоты в новых гидролизных средах

  

Для получения дикарбоновых кислот из некрахмального растительного сырья были выполнены следующие исследования и разработки:

- проведен анализ растительных субстратов, включая измельченную древесину лиственных пород, свекловичный жом, клубни и зеленые побеги топинамбура. 

- клонирован ген, кодирующий экзоинулиназу в системе экспрессии микромицетных грибов рода Penicillium для получения штаммов- продуцентов целевых ферментов, обладающих инулиназной и целлюлазной активностями; 

- проведен скрининг полученных трансформантов, выбраны штаммы, несущие гены целлюлаз и инулиназ с высокой продуктивностью;

- проведены мероприятия по оптимизации условий культивирования выбранных штаммов P. verruculosum INU13 и INU18, изучены процессы биосинтеза целевых ферментов в зависимости от условий; штаммы задепонированы в ВКПМ.

- на основе выбранных штаммов получены ферментные препараты с повышенной гидролитической способностью для гидролиза полисахаридов клубней топинамбура;

- проведена селекция микроорганизмов для получения фумаровой и молочной кислоты, подобраны штаммы грибов рода Rhizopus и бактерий рода Lactobacillus, способные осуществлять микробиологическую конверсию сахаров в молочную и фумаровую кислоты;

- получены биокатализаторы в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-1032 в поливиниловом спирте, отработана лабораторная технология получения иммобилизованного биокатализатора;

- проведена конверсия ферментолизатов клубней топинамбура  в фумаровую кислоту под действием биокатализаторов в виде свободных и иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-1032, показано, что иммобилизованный биокатализатор более эффективен;

- проведены наработки опытных партий гидролизатов растительного сырья;

- проведена наработка партии фумаровой кислоты (фумарата) на основе гидролизатов предобработанного растительного сырья; выбраны условий проведения процесса выделения и очистки фумаровой кислоты с применением анионообменной хроматографии, получены образцы фумаровой кислоты.

- проведена наработка партии молочной кислоты (лактата) на основе гидролизатов предобработанного растительного сырья; выбраны условий проведения процесса выделения и очистки молочной кислоты с применением анионообменной хроматографии и методом экстракции с применением органического растворителя;

- проведена оптимизация условий элюирования лактат-ионов с хроматографической колонки, проведено лабораторное масштабирование процесса выделения лактат-ионов при использовании анионита АВ-17-8-чс, проведено обесцвечивание и получены образцы молочной кислоты;

- были проведены исследования экспериментальных образцов новых ферментных препаратов PVERINU13 и PVERINU18. Доля целлюлаз в комплексном ферментном препарате PVERINU18, являющимся мультиферментным, составляет 59,4% при этом доля экзоинулиназы- 28,6% В препарате PVERINU13 доля экзоинулиназы составляет 45%.

- проведено исследование экспериментальных образцов штаммов микроорганизмов-продуцентов фумаровой кислоты в новых гидролизных средах. Степень конверсии глюкозы в фумаровую кислоту под действием R. oryzae F1032 составила от 109 до 329 %

- разработан лабораторный регламент получения ферментных препаратов с повышенной гидролитической активностью по отношению к предобработанной возобновляемой биомассе растений.

- разработаны лабораторные регламенты получения фумаровой и молочной кислот.

Растительное некрахмальное сырье (свекловичный жом, клубни топинамбура, отходы лесопереработки и растениеводства) являются важным и недорогим источником сырья для микробиологического синтеза. При этом не возникает конкуренции с пищевыми продуктами, что характерно для крахмалосодержащего сырья.
Высокое содержание инулина топинамбура определяет его биотехнологическую значимость. Инулин как из клубней, так и из стеблей является сырьём для производства широкого спектра биотехнологически важных продуктов, таких как технические фруктоза и глюкоза, а на их основе молочной кислоты, биотоплива и многих других продуктов для химического синтеза.
Ферментативный гидролиз биомассы топинамбура является экологически чистым процессом и происходит под действием инулиназного комплекса ферментов– набора эндо- и экзо инулиназ, гидролизующих молекулы инулина- основного полисахарида топинамбура с получением олигосахаридов и простых (фруктозы и глюкозы) технических сахаров. С помощью клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae и бактерий рода Lactobacillus, полученные сахара могут быть превращены в востребованные промышленностью карбоновые кислоты – фумаровую, молочную кислоты и другие продукты микробиологического синтеза.
Фумаровая кислота относится к подклассу дикарбоновых кислот и была определена, вместе с яблочной и янтарной кислотами, в качестве одного из десяти «строительных блоков» химических веществ, которые могут быть получены из сахаров путем биологической или химической конверсии растительной биомассы, что определяет несомненную значимость ее использования. Она используется в
производстве лекарств, напитков, продуктов питания, кормов для животных, моющих средств, ненасыщенных полиэфирных, алкидных смол и печатных красок.