Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0133

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0133
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Создание тканеинженерной конструкции на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур
Докладчик
Дюжева Татьяна Геннадьевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели исследования 1 – разработка метода создания универсальной трехмерной нанобиоконструкции – тканеинженерной конструкции желчного протока из биосовместимых материалов нового поколения на уровне мировых разработок для придания требуемых свойств биологическим системам, способствующего развитию биологии и медицины, 1.1 – разработка тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур.

Для достижения целей необходимо решить ряд последовательных задач: 1 – получение биосовместимого и биоразлагаемого волокнистого нетканого материала для создания каркаса для трехмерных нанобиоконструкций, 2 – изготовление биосовместимого каркаса из волокнистого материала для трехмерных нанобиоконструкций, 3 – создание тканеинженерной конструкции на основе биосовместимого каркаса и нанобиологического материала с проведением скрининга на линейных культурах клеток и с подтверждением адекватности заявленного применения на культурах специальных соматических и стволовых клетках.
Конечным результатом проекта должно быть создание прототипа тканеинженерной конструкции желчного протока и проект технического задания на проведение ОКР по теме «Проведение доклинических испытаний тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами».
Актуальность и новизна исследования
В России разработаны ряд перспективных методов нанобиотехнологии (получение полимерных нанокомпозитов, электроформование и создание трубчатых структур), которые можно использовать для изготовления новых медицинских изделий. Использование биоразлагаемых полимерных эндопротезов особенно актуально в абдоминальной хирургии при повреждении желчных протоков. Ежегодно в России регистрируется 800 тысяч новых случаев желчнокаменной болезни, ежегодно операции по удалению желчного пузыря проводятся у 260 тыс. больных. Частота повреждения желчных протоков во время операций остается на высоком уровне и колеблется от 0,3 до 3%. Одной из главных причин развития осложнений при реконструкциях желчного протока является исключение естественного пассажа желчи в двенадцатиперстную кишку и запирательной функции сфинктера Одди, поддерживающего баланс микробиотного состава желчных путей от интервенций микрофлоры кишечной трубки. Восстановительные операции обеспечивают сохранность функции сфинктера Одди, однако, долгое время считались неэффективными в связи с большой частотой развития стриктуры протока. Наиболее эффективным методом решения этой проблемы является разработка тканеинженерного желчного протока на основе биосовместимых биоразлагаемых полимеров. В настоящее время, несмотря на большой интерес к данной проблеме (данные мировой литературы, анализ нормативно-технической документации, патентных исследований), подобные продукты на рынке лечения заболеваний желчных протоков отсутствуют.
Научно-технический уровень разработки соответствует мировым стандартам по новизне, изобретательскому уровню и будущему клиническому применению.
Описание исследования

Пути достижения результатов включали последовательное выполнение этапов по разработке технологии получения волокнистого нетканого биодеградируемого материала из различных полимеров, выбору оптимального на основе их сравнительных характеристик, изготовление из выбранного полимера каркаса-трубки с дальнейшим созданием тканеинженерной конструкции на основе биосовместимого каркаса с многослойным клеточным покрытием.

Для определения направления исследований и их соответствия мировому уровню проведен аналитический обзор информационных источников и патентных исследований, объектом которых были способы создания билиарного стента и универсальной трехмерной нанобиоконструкции, представляющей собой каркас из биодеградируемого материала с многослойным клеточным покрытием, которая может быть использована для восстановления желчного протока.

Для получения биосовместимого и биоразлагаемого материала для создания каркаса танеинженерной конструкции использовали метод электроформования. Согласно требованиям ТЗ, материал должен представлять композит, включающий не менее двух биосовместимых компонент, обладающий свойствами содержать в составе не менее одной компоненты, нерастворимой в воде, иметь волокнистую структуру с диаметром волокон не менее 300 нм, быть проницаемым для водных растворов, поддерживать пролиферацию клеток, обладать возможностью модификации сигнальными биологически активными веществами. Каркасы, изготовленные из выбранного материала должны представлять собой трубку диаметром 3-6 мм, длиной не менее 1,5 см, толщиной стенок – не менее 100 мкм, по своим физико-биологическим характеристикам быть близки к структурам человеческого тела, включать не менее 3 слоев,  быть непроницаемыми для желчи, обладать устойчивостью и способностью к длительному существованию в организме (деградация каркаса в модельных средах не менее 1 месяца), быть пластичными (относительное удлинение δ до 5% без разрыва при проведении испытаний на растяжение).

Проведены исследования по изучению структуры и определению комплекса физико-механических свойств биосовместимых материалов, полученных методом электроспиннинга из 4 исходных полимеров: PCL, PLDGA, PLCL, ДАЦ. Изучали диаметр волокон (оптическая и электронная микроскопия), диаметр пор, плотность упаковки, толщина образца, прочность и разрывная деформация (масштабированный тест ASTM D1414-94), измерение краевых углов смачивания (анализ формы капли KRUSS DSA 30E, Германия). Проведены испытания кинетики биодеградации образцов биосовместимого каркаса в различных средах (воде, фосфатном буфере, реактиве Фентона, культуральной среде с сывороткой и без нее). Для разработки ЛТР получения биосовместимого нетканого материала с помощью процесса электроформования изучены реологические свойства растворов из разных полимеров, использованных в работе, и их электропроводность. Выявлена зависимость структуры материала (диаметра волокна, плотности упаковки, диаметра пор и толщины слоя) от основных параметров технологических параметров процесса формования: производительности, межэлектродного расстояния, подаваемого напряжения и времени наработки. Определены зависимости диаметра волокон нетканого материала в зависимости от подаваемого напряжения, производительности процесса и межэлектродного расстояния, изучено влияние межэлектродного расстояния на размер пор нетканого материала, исследована зависимость толщины материала от времени наработки.  

После выбора оптимального материала и разработки плана исследований, направленных на создание каркаса конструкции, проведены исследования по созданию различных вариантов каркаса методом электроформования.  Были проведены исследования взаимосвязи между структурой и свойствами различных вариантов каркаса с использованием современных методик, включая методы оптической микроскопии, атомно-силовой микроскопии, измерения контактного угла смачивания, сканирующей электронной микроскопии.

Далее был составлен план исследований, необходимых для получения тканеинженерной конструкции желчного протока, включающий этап модификации каркаса смесью биологически активных веществ, в том числе Неоваскулгена, этап многослойного заселения модифицированного каркаса, этап изучения физико-механических свойств конструкции. Выбраны условия хранения образцов конструкции.

Проведены дополнительные патентные исследования (методики выделения и культивирования эпителиоцитов общего желчного протока и способ заселения каркаса конструкции клетками).

Результаты исследования

1 этап.  Анализ литературы (139 источников) по биоматериалам в тканевой инженерии и методам их изготовления показал, что одним из наиболее перспективных является метод электроформования. Изучено 160 источников патентной документации, по объектам поиска выбрано 47, анализ показал, что охраноспособность проводимого исследования может быть подтверждена как на российском, так и на мировом уровне. Проведены теоретические и экспериментальные исследования, в результате которых были отработаны технологические условия проведения электроформования. Отработана технология получения и использования мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК КМ). 

2 этап. Исследования по изучению структуры и определению комплекса физико-механических свойств биосовместимых материалов показали, что разработанный технологический процесс позволяет изготавливать их из волокон различного диаметра, в диапазоне 1,2-11,0 мкм, с плотностью упаковки 5-17% и диаметром пор в диапазоне 10-67 мкм. По прочности все материалы существенно не отличаются от данных нативного желчного протока (не менее 5,35 МПа). Подготовлен ЛТР получения материала и было изготовлено 8 типов образцов (по 5 штук размером 5х5 см). В результате проведения скрининга с применением линий клеток 3T3 и MCF7 и с использованием методов световой микроскопии и MTT-теста для оценки адгезии и пролиферации клеток выявили оптимальные материалы: сополимеры L полилактида с поликапролактоном и полигликолидом. Был разработан способ динамического культивирования, пригодный для повышения эффективности заселения каркаса клетками. Были отработаны этапы получения и использования эпителиоцитов желчного протока в условиях чистых помещений 5-6 класса по ISO.

3 этап. Разработаны технологические приемы, позволяющие изготавливать многослойные трубчатые каркасы желчных протоков, по своим свойствам, приближающиеся к естественным. На основании ЛТР получения биосовместимого каркаса для создания тканеинженерной конструкции желчного протока были изготовлены образцы биосовместимого каркаса с использованием полимеров PCL, PLDGA, PLCL, ДАЦ. Экспериментальные образцы изготовлены в количестве 55 шт, длиной 35 мм, внутренним диаметром 4,3 мм. Проведенные исследования по биодеградации образцов каркаса в различных средах, особенно в желчи, показали целесообразность использования в качестве материала каркаса PCL, PLCL, ДАЦ (стабильны более 2 недель). Были разработаны СОП по всем этапам процессинга МСК КМ и эпителиоцитов желчных протоков. Получен патент РФ на полезную модель «Каркас для протезирования желчного протока».

4 этап. Подобран режим изготовления модифицированных каркасов из эмульсии с использованием плюроника F-127, позволяющий внедрять биологически активные соединения: флуоресцентные белки, эпидермальный фактор роста EGF, Неоваскулген или их смеси в необходимой концентрации. Волокнистые слои из ПКЛ при модификации уменьшают свою прочность на 60-70% (на уровне нативного протока). Структура каркасов позволяет клеткам заселять его на всю глубину. Образцы тканеинженерной конструкции желчного протока должны храниться в защищенном от света месте при температуре 2-4 оС, в течение, не более, 3 месяцев. Было проведено заселение клеточными культурами МСК КМ и эпителиоцитов желчных протоков модифицированного каркаса с оценкой жизнеспособности (86-94%), клетки образовали 2 слоя в составе конструкции.

Практическая значимость исследования
Будет разработана потенциально коммерциализируемая технология, которая позволит создавать новые продукты регенеративной медицины – трубчатые органы, а также создаст задел для разработки технологий формирования более сложных органов.
Использование разработанного способа изготовления трубчатых тканеинженерных конструкций позволит в кратчайшее время наладить производство подобных изделий при минимальных материальных затратах. Разработанные лабораторные технологии формирования трубчатых тканеинженерных конструкций, безусловно, будут способствовать международному сотрудничеству в области разработки, доклинических и клинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. Проведенные патентные исследования показывают, что изобретение патентоспособно как в РФ, так и за рубежом.
Для российского здравоохранения результаты ПНИ будут, несомненно, важны, т.к. на базе ведущего вуза Минздрава начнут функционировать инфраструктура создания и выведения на рынок новых видов продукции – биомедицинских клеточных продуктов, будут реализовываться механизмы воплощения инновационных идей в конечный продукт.
Постер

Poster.ppt