Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0065

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0065
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Разработка тест-системы для выявления и анализа лекарственной устойчивости инфекционных агентов, приводящих к нарушениям репродуктивных функций.
Докладчик
Кубанов Алексей Алексеевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования – разработка тест-системы на основе ДНК-чипов для идентификации возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций (ИПНРФ), с одновременным определением генетических детерминант резистентности к спектру антимикробных препаратов (АМП).
Задачами проекта являлись:
- формирование и поддержание коллекции образцов возбудителей ИПНРФ для проверки компонентов тест-системы и испытаний макетов;
- установление спектра молекулярных маркеров – генетических детерминант лекарственной устойчивости;
- конструирование специальных реагентов для идентификации молекулярных маркеров;
- разработка процедур амплификации и гибридизации;
- создание компонентов тест-системы, обеспечивающих проведение анализа геномов возбудителей ИПНРФ;
- разработка технической документации для выпуска макетов тест-системы, производство макетов тест-системы;
- лабораторные и клинико-лабораторные испытания макетов с использованием образов из сформированной коллекции;
- оценка диагностических характеристик тест-системы, включая разработку проекта методических рекомендаций по использованию тест-системы в клинико-диагностических лабораториях учреждений дерматовенерологического профиля РФ;
- мероприятия по подготовке производства на мощностях индустриального партнера, с целью дальнейшего выпуска тест-системы и ее государственной регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения РФ.
Актуальность и новизна исследования
Инфекции органов репродукции человека могут быть представлены как облигатными патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Mycoplasma genitalium), так и различными оппортунистическими микроорганизмами (Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma sp. и др.), в норме присутствующими в репродуктивном тракте в следовых количествах. Медико-социальная актуальность ИПНРФ определяется негативным воздействием на репродуктивную функцию, в значительном проценте случаев приводящим к развитию вторичного мужского и женского бесплодия. Этиология ИПНРФ часто носит полимикробный характер, что усугубляет клиническую картину заболевания, снижает специфичность диагностики и в итоге может привести к назначению неадекватной терапии.
Современная лабораторная диагностика ИПНРФ базируется на использовании ДНК-технологий и включает варианты мультиплексной ПЦР, анализ метагенома репродуктивного тракта методами секвенирования нового поколения. Перечисленные подходы позволяют, в основном, получить представления только о спектре возбудителей безотносительно их чувствительности к АМП. Технология гибридизации на специализированных ДНК-чипах, позволяющая в одном анализе проводить детекцию десятков генов с оценкой множества полиморфизмов, характеризующих видовую принадлежность идентифицируемых микроорганизмов и присутствующие у них маркеры антибиотикорезистентности, представляется перспективной для решения задач лабораторной диагностики возбудителей ИПНРФ.
Описание исследования

Формирование коллекции возбудителей ИПНРФ проводили посредством сбора клинического материала, полученного от пациентов с признаками воспалительных заболеваний органов репродуктивного тракта в ФГБУ ГНЦДК. Собранный материал использовали для проведения следующих процедур:

- выделения ДНК с последующей идентификацией возбудителей ИПНРФ методом ПЦР в реальном времени с использованием коммерческих тест-систем;

- посева материала на селективных средах с выделением чистых культур возбудителей ИПНРФ, их видовой идентификацией и определением профиля антибиотикорезистентности.

Для культивируемых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов производили посев клинического материала на дифференциально-диагностические и селективные среды (Becton Dickinson, США). Идентификацию представителей класса Mollicutes проводили на среде Mycoplasma DUO (Bio-Rad, США).

Масс-спектрометрическую видовую характеризацию образцов выполняли методом прямого профилирования с помощью времяпролетного масс-спектрометра с ионизацией MALDI Microflex (Bruker Daltonics GmbH, Германия) с использованием системы MALDI Biotyper.

Полученные культуры возбудителей ИПНРФ проверялись и анализировались в отношении чувствительности к АМП с использованием микробиологического анализатора Vitek II (bioMerieux, Франция).

В случае принадлежности возбудителя ИПНРФ к числу некультивируемых микроорганизмов (T. pallidum) идентификацию маркеров резистентности проводили молекулярно-генетическими методами. Исследовали гены tromp (маркер устойчивости к β-лактамам), tetB, 16S рРНК, детерминирующие устойчивость к тетрациклинам, ген 23S рРНК, вовлеченный в устойчивость к макролидам.

Определение генетических детерминант устойчивости к АМП проводили посредством таргетного секвенирования геномов возбудителей ИПНРФ. Устанавливали перечень геномных мишеней, вовлеченных в формирование резистентности возбудителей ИПНРФ. Секвенирование локусов геномов возбудителей ИПНРФ проводили в ЦКП «Геном» ИМБ РАН с помощью набора ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе ABI 3730 DNA Analyzer. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программ Vector NTI 9.1 и DNA Star 7.1.0.

Специальные реагенты СР (олигонуклеотиды для иммобилизации и праймеры для амплификации) конструировали согласно разработанным ранее алгоритмам (Gryadunov et al. 2005; Zimenkov et al. 2015). Синтез СР проводили на автоматическом синтезаторе ABI-394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартного фосфорамидитного метода, олигонуклеотиды включали спейсер со свободной аминогруппой 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Research, США) для иммобилизации на гидрогелевом ДНК-чипе. Очистку СР выполняли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (Gilson, Франция).

ДНК-чипы на основе гидрогелей изготавливали с использованием УНУ «Комплекс по изготовлению биочипов» ИМБ РАН (патент ЕС EP 1437368; патент РФ № 2216547, http://www.ckp-rf.ru/usu/352445/). Индустриальным партнером проекта – ООО «БИОЧИП-ИМБ» проведена верификация качества изготовленных подложек ДНК-чипов.

Амплификацию исследуемых фрагментов геномов возбудителей ИПНРФ проводили с использованием адаптированного метода мультиплексной ПЦР с циклической элонгацией (Zimenkov et al. 2016), обеспечивающего равномерную амплификацию геномных локусов с разным GC-составом и эффективное встраивание флуоресцентного субстрата в ДНК. Гибридизацию полученных флуоресцентно-меченных ПЦР-фрагментов на гидрогелевых ДНК-чипах проводили согласно описанной ранее процедуре (Zimenkov et al. 2016).

При проведении лабораторных и клинико-лабораторных испытаний макетов разрабатываемой тест-системы в качестве референс-методов использовали коммерческие наборы для ПЦР в реальном времени, автоматизированные системы культивирования микроорганизмов для установления фенотипических паттернов антибиотикорезистентности и методы таргетного секвенирования, включая  технологии секвенирования следующего поколения (NGS).

Результаты исследования

Разработан метод и макет тест-системы на основе гидрогелевого ДНК-чипа, обеспечивающий обнаружение ДНК 17 возбудителей ИПНРФ, в том числе T. pallidum, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium,T. vaginalis, M. hominis, G. vaginalis, U. parvum, U. urealiticum, A. vaginae, E. faecalis,  E. coli, M. mulieris, S. anginosus, F. nucleatum, S. epidermidis, B. fragilis, с одновременной идентификацией 49 генетических детерминант резистентности к широкому спектру АМП.

Принцип действия тест-системы основан на молекулярно-генетическом анализе геномной ДНК бактериальных возбудителей ИПНРФ на ДНК-чипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие видоспецифичному полиморфизму гена 16S рРНК для идентификации возбудителей, а также зонды, специфичные к последовательностям генов rrs, rrl, gyrA, parC, mefA, mtrR, nimB-G, penA, ponA, porB, rpsJ, ntr4tv, ntr6tv, blaSHV, blaTEM, tetM, tetO, являющихся генетическими детерминантами резистентности возбудителей ИПНРФ к антибиотикам пенициллинового ряда, цефалоспоринам, тетрациклинам, фторхинолонам, макролидам, нитроимидазолам, спектиномицину. Процедура анализа включает мультиплексную ПЦР с одновременным флуоресцентным маркированием исследуемых сегментов геномов с последующей гибридизацией на ДНК-чипе. С целью повышения надежности идентификации и дифференциации микроорганизмов и их маркеров устойчивости, особенно при анализе смесей, разработан и реализован алгоритм расчета дискриминационных отношений между совершенными и несовершенными дуплексами ДНК-чипа после проведения гибридизации, с учетом разброса концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов, оцениваемого по внутреннему флуоресцентному контролю каждого зонда.

Разработан комплект технической документации (ТД) на тест-систему, включающий чертеж общего вида, лабораторно-технологический регламент, проект инструкции по применению тест-системы. По разработанной ТД для проведения лабораторных и клинико-лабораторных испытаний изготовлено, суммарно, 100 макетов тест-системы, каждый из которых рассчитан на проведение 50 анализов, исключая контрольные образцы.

Проведенные с использованием более 300 образцов ДНК возбудителей ИПНРФ лабораторные и клинико-лабораторные испытания макетов тест-системы показали, что диагностические чувствительность и специфичность тест-системы при идентификации возбудителей ИПНРФ составили не менее 95%, а диагностические чувствительность и специфичность при идентификации генетических детерминант устойчивости – не менее 90%. Полученные значения диагностических характеристик тест-системы ВИЗОР-ТЕСТ соответствуют мировому уровню разрабатываемых сегодня диагностических тестов, например, для идентификации генетических детерминант резистентности N. gonorrhoeae (Dona et al. 2016; Wind et al. 2016; Low and Unemo, 2015).

Практическая значимость исследования
Результатом проекта стало создание чувствительной и специфичной тест-системы для анализа возбудителей ИПНРФ, позволяющей решать весь спектр задач лабораторной диагностики данной этиологически разнообразной и часто резистентной к терапии группы заболеваний. Решение данной задачи позволит существенно повысить качество лабораторной диагностики ИПНРФ и эффективность последующего лечения за счет выбора варианта персонализированной антибиотикотерапии.
Проведенные маркетинговые исследования свидетельствуют о хороших перспективах набора реагентов ВИЗОР-ТЕСТ на рынке диагностики in vitro при текущем уровне диагностических систем за счет большого числа одновременно определяемых возбудителей и возможности определения устойчивости к АМП.
ФГБУ ГНЦДК Минздрава РФ является организацией, аккредитованной Росздравнадзором для проведения клинических испытаний медицинских изделий, обладает значительным опытом внедрения новых диагностических тестов и лекарственных средств в медицинскую практику. Индустриальный партнер - компания «БИОЧИП-ИМБ», в рамках проекта занимавшаяся работами по подготовке производства тест-системы, успешно коммерциализирует последние разработки в области тест-систем на основе биочипов для диагностики туберкулеза. Квалификация и опыт данного альянса является залогом для дальнейших успешных работ по государственной регистрации тест-системы, ее выпуску и коммерциализации.
Рынок коммерциализации тест-системы включает клинико-диагностические лаборатории учреждений дерматовенерологического профиля РФ, центры акушества и гинекологии, родильные дома, урологические центры МЗ РФ, государственные и частные лаборатории, выполняющие анализы in vitro. Суммарный объем продаж тест-системы после ее государственной регистрации в Росздравнадзоре может составить не менее 30 млн руб. в год, количество лабораторий, применяющих тест-систему – не менее 120. Прогнозный объем продаж, начиная с 2021 г. – до 100 млн. руб в год, количество лабораторий, применяющих тест-систему – не менее 200.