Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0067

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0067
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Название доклада
Разработка конъюгированной вакцины нового поколения для обеспечения высокоэффективной профилактики брюшнотифозной инфекции
Докладчик
Шемякин Игорь Георгиевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Задачей проекта является создание брюшнотифозной вакцины нового поколения, обеспечивающей повышение эффективности защиты населения от инфекции Salmonella typhi.
Целью проекта является разработка технологии получения вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi и рекомбинантного белкового антигена, эффективно стимулирующего иммунный ответ, в частности, активацию CD4+ Т-лимфоцитов (Т-хелперов), способствующего развитию иммунологической памяти, увеличению титра нейтрализующих антител и индукции переключения изотипов антител.
Конечным результатом проекта является получение прототипа конъюгированной вакцины, вызывающей высокий протективный эффект, выраженный в высоком титре антиген-специфических IgG, превосходящем титр, наблюдающийся при применении неконъюгированной полисахаридной вакцины. Разработанный прототип может быть использован для создания фармацевтического препарата брюшнотифозной вакцины, обеспечивающего длительный протективный иммунитет у взрослых и детей от 2 лет.
Актуальность и новизна исследования
Разработка и введение профилактический арсенал медицинских учреждений конъюгированных вакцин против бактериальных инфекций, вызываемых, в частности, такими опасными возбудителями как Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae, является одним из наиболее значимых достижений мирового здравоохранения за последние 25 лет. Эти вакцины привели к существенному снижению детской заболеваемости и смертности во всем мире за счет их универсальной способности индуцировать пролонгированный иммунитет у различных возрастных групп населения, сокращая носительство и предотвращая передачу инфекции. В данный момент в мире проводится разработка нескольких препаратов конъюгированных брюшнотифозных вакцин. Например, на протяжении ряда последних лет конъюгированная вакцина на основе Vi-антигена и белкового партнёра разрабатывается в Индии, однако, несмотря на положительные результаты ряда испытаний, иммунный ответ на конъюгаты с классическими белками-носителями в значительных пределах варьирует, что неприемлемо для вакцины широкого применения. Поэтому в ряде стран, в том числе несколькими группами в США с участием индийских исследователей, ведётся разработка нового поколения вакцины, учитывающего недостатки предыдущих вариантов, и основанного на использовании новых белковых антигенов-партнёров для конъюгации. Разрабатываемая авторами проекта технология в целом является исследованием в близком направлении и находится на мировом уровне.
Материалы, методы и подходы, разработанные в рамках данного проекта, могут быть использованы в создании других прототипов конъюгированных вакцин, предназначенных для профилактики бактериальных инфекций.
Описание исследования

На первом этапе выполнения проекта было проведено исследование путей создания вакцины, основанной на применении рекомбинантных белков - стимуляторов иммунного ответа, включая теоретическое обоснование отбора белков-партнеров для создания конъюгированной вакцины, дизайн последовательностей, кодирующих белковые антигены-партнёры для конъюгации с учётом кодонной оптимизации трансляции и обеспечения эффективной технологии очистки рекомбинантного белкового антигена-партнёра. Была разработана лабораторная методика наработки и очистки Vi-антигена S.typhi, включающая наращивание биомассы продуцента, получение кальциевого экстракта Vi-антигена из цетавлонового осадка и удаление примесей белков и нуклеиновых кислот из конечного препарата, позволившая провести наработку Vi-антигена для проведения экспериментов и изучение физико-химических характеристик Vi-антигена S.typhi с помощью 13С-ЯМР спектроскопии, ракетного иммуноэлектрофореза и преципитации в геле по методу Оухтерлони. Для полученных препаратов Vi-антигена было проведено экспериментальное исследование иммунологических и протективных свойств при иммунизации лабораторных животных.

На втором этапе выполнения проекта с помощью генно-инженерных подходов были сконструированы штаммы-продуценты рекомбинантных белковых антигенов-партнеров для конъюгации – дифтерийного анатоксина CRM197, флагеллина fliC и его фьюжн-производного с мембранным белком сальмонелл pagN, экзотоксина А синегнойной палочки rEPA. Последовательности, кодирующие белки fliC и pagN были получены прямой ПЦР с генома возбудителей, а последовательности, кодирующие CRM197 и rEPA были синтезированы при помощи ПЦР с перекрывающихся праймеров. Экспрессионные конструкции, обеспечивающие продукцию белковых антигенов-партнеров, были получены на базе экспрессионных векторов системы pET (Novagen). Белки-партнеры для конъюгации были наработаны в гетерологичной системе экспрессии в E.coli и очищены методами ВЭЖХ, включающими металл-хелатную, ионнообменную и гель-фильтрационную хроматографию. 

На третьем этапе выполнения проекта проведена разработка нового технического принципа создания конъюгированной вакцины на основе синтеза тиоэфиров Vi-антигена в безводных условиях в присутствии DCC и ароматических тиолов. Была определена оптимальная технология ковалентной конъюгации белка с Vi-антигеном S. typhi, включающая модификацию тиоэфира Vi-антигена аминопроизводным DIBO-алкина и модификацию белка-носителя N-гидроксисукцинимидным производным азида с последующей клик-химической конъюгацией Vi-антигена и белка-носителя. С помощью созданной технологии ковалентной конъюгации были получены экспериментальные образцы конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе Vi-антигена S.typhi и рекомбинантных белков-партнеров.

На четвертом этапе выполнения проекта были разработаны и апробированы схемы иммунизации лабораторных животных, предусматривающие однократную иммунизацию экспериментальными образцами конъюгированной брюшнотифозной вакцины. Была разработана методика анализа иммунного ответа на вакцинацию, включающая определение уровня гуморального ответа методом иммуноферментного анализа (ИФА) и исследование количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных животных на основе гемолиза эритроцитов барана. С использованием разработанной методики были проведены экспериментальные исследования иммунного и протективного ответа у лабораторных животных на вакцинацию экспериментальными образцами конъюгированной бюшнотифозной вакцины.

На пятом (заключительном) этапе выполнения проекта проводились обобщение и выводы по результатам выполнения проекта и разработка нормативно-технической документации на получение конъюгированной брюшнотифозной вакцины (технические условия, лабораторный регламент).

Результаты исследования

C применением разработанной методики было наработано и очищено 2 серии препарата (5 и 7) Vi-антигена S.typhi массой 100 и 120 мг. Количество примесей белков (по Бредфорд) и нуклеиновых кислот (по Спирину) в полученных образцах Vi-антигена S.typhi не превышало 1% и 2%, соответственно. По данным 13С-ЯМР спектроскопии обе серии Vi-антигена S.typhi содержали не менее 1 мкм иммунодоминантных О-ацетильных групп на 1 мг сухого препарата. В реакции преципитации в геле по Оухтерлони препараты Vi-антигена S.typhi в концентрации 50 мкг/мл образовывали дугу преципитации, идентичную референс-препарату Vi-антигена S.typhi. С помощью ракетного иммуноэлектрофореза была подтверждена специфическая активность препаратов. Препараты Vi-антигена S.typhi при введении кроликам в дозе 0,025 мкг/кг не вызывали подъёма температуры, что соответствует критериям апирогенности. Пик АОК у мышей после введения препаратов в дозе 25 мкг/мышь отмечался на 7 сутки и составил 27,4 АОК на 10(6) клеток, в иммунном ответе доминировала продукция анти-Vi антител IgG класса. Оба препарата Vi-антигена при внутрибрюшинном введении в диапазоне доз 0,00025 – 25 мкг/мышь обеспечивали 100% выживаемость при заражении мышей S.typhi Ту2 Ту-2 № 4446 в количестве 1000 клеток/мышь (80 ЛД50).  

Уровень продукции рекомбинантных белковых антигенов-партнеров полученными штаммами-продуцентами составил 50-100 мг с литра бактериальной культуры. Чистота белковых препаратов, оцененная на основе методов ДСН-ПААГ, составила 95%, а содержание эндотоксина в препаратах не превышало 5 IU на 1 мг белка. 

Сравнение различных подходов к синтезу конъюгированной вакцины позволило подобрать оптимальную технологию ковалентной конъюгации белка с Vi-антигеном S. typhi, включающую модификацию тиоэфира Vi-антигена аминопроизводным DIBO-алкина и модификацию белка-носителя N-гидроксисукцинимидным производным азида с последующей клик-химической конъюгацией Vi-антигена и белка-носителя. С применением данной технологии конъюгации были получены экспериментальные образцы конъюгированной брюшнотифозной вакцины в вариантах СRM197-Vi антиген S.typhi, fliC-Vi антиген S.typhi, fliC:pagN-Vi антиген S.typhi и repA-Vi антиген S.typhi. Было показано, что выход конъюгата составляет 50-70% по Vi-антигену и 50-60% по белку-партнеру. В тестах на кроликах было подтверждено, что полученные конъюгаты апирогенны и нетоксичны. Результативность разработанного метода конъюгации соответствует литературным данным о наиболее эффективных способах получения вакцинных конъюгатов [Патент WO2015029056, статья PMC4163788].

Экспериментальные исследования иммунного ответа, вызванного введением образцов вакцины, показали, что в присутствии белка-партнера максимальный уровень иммунного ответа достигается на 14 сутки, при этом преобладают антитела класса IgG в титре в 8-16 раз превышающем таковой в ответ на вакцинацию неконъюгированным Vi-антигеном. Вакцинные конъюгаты при внутрибрюшинном введении в дозе 50 нг/мышь обеспечивали 100% выживаемость при заражении бактериями S.typhi в количестве 1000 клеток на мышь (80 LD50). Было установлено, что наиболее эффективным кандидатным вакцинным препаратом является экспериментальный образец брюшнотифозной вакцины Vi-ST-fliCpagN. Аналогов данного варианта вакцины в мире ранее не разработано. Завершается разработка нормативно-технической документации на получение конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе данного образца.

Практическая значимость исследования
Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть применены в здравоохранении, практической медицине, эпидемиологии, иммунобиологии, а также в биотехнологических разработках. Созданный в ходе выполнения проекта прототип химической конъюгированной брюшнотифозной вакцины будет в дальнейшем адаптирован к промышленному производству и пройдет доклинические и клинические испытания на базе компании ООО "ГРИТВАК" - Индустриального партнера проекта.
Белковые антигены-носители, исследованные в ходе выполнения проекта, будут применены для создания других конъюгированных вакцин. Коммерциализация полученных препаратов будет заключаться как в разработке и дальнейшей продаже вакцины, так и в коммерциализации белков-партнеров для создания вакцин. Рынками сбыта полученного препарата вакцины будут Российская Федерация, страны Средней и Юго-Восточной Азии и некоторые страны Африки. Суммарная емкость рынка на данных направлениях составляет более 100 млн. долл. в год. Объем продаж вакцины на внутреннем рынке может составить 5-7 млн. долл. в год, а на рынке среднеазиатских республик он составляет до 10 млн. долл. в год в 5-летней перспективе.
В мире уже применяется ряд конъюгированных вакцин для профилактики бактериальных инфекций, и дополнительно широкий набор вакцин (стафилококковая, псевдомонадная и др.) находятся в разработке. Несмотря на обоснованную высокую эффективность и преимущества конъюгированных вакцин, в России (за исключением настоящего исследования) их разработка не проводится. Исследуемые технологии получения и испытания брюшнотифозной вакцины являются первым элементом отечественной технологической платформы по созданию конъюгированных вакцин для профилактики различных бактериальных инфекций. Создание подобной платформы для разработки и испытаний конъюгированных вакцин окажет влияние на исследования в области фундаментальной иммунологии патогенов, а также на расширение инновационных производств импортозамещающих и полностью новых иммунобиологических препаратов, в том числе, экспортоориентированных. Информация о разработке новых вакцин в Российской Федерации способствует развитию и популяризации российской науки и медицинской биотехнологии.