Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0102

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0102
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Название доклада
Разработка эпигенетических сигнатур для выявления колоректального рака на ранних стадиях
Докладчик
Малышев Борис Сотиволдиевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели:
1. Создание эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на ранних стадиях.
2. Разработка экспериментальной партии инновационной эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на основе GLAD ПЦР технологии; оценка их чувствительности и специфичности на экспериментальном и клиническом материале.

Задачи:
1. Разработка метода выявления маркеров метилирования ДНК в образцах плазмы крови на основе GLAD-ПЦР анализа.
2. Выбор генов-кандидатов и проведение скрининга образцов ДНК из плазмы периферической крови, полученных от различных групп больных и здоровых доноров, на предмет их метилирования.
3. Формирование сигнатур эпигенетических маркеров для колоректального рака.
4. Создание лабораторного экспериментального образца эпигенетической тест-системы (на основе разработанных сигнатур) для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР анализа.
5. Исследование количественных параметров лабораторного экспериментального образца тест-системы.
Актуальность и новизна исследования
Высокий уровень смертности в России от онкологических заболеваний обусловлен поздним выявлением патологии. Поэтому одной из важнейших проблем современной онкологии является разработка эффективных методов ранней диагностики. В настоящее время в клинике для ранней диагностики применяются такие методы как определение белковых онкомаркеров в крови и генетическое тестирование. Однако большинство ИФА-тестов на онкомаркеры обладают чувствительностью порядка 60%, а анализ генома выявляет только наследственные формы рака, которых не более 10% от общего количества онкозаболеваний. Кроме того, он является чрезвычайно ресурсоемким и дорогостоящим.
На сегодняшний день наиболее перспективным инструментом диагностики и мониторинга онкологических заболеваний является эпигенетическая диагностика – анализ маркеров метилирования ДНК (эпигенетических маркеров). Показано, что именно метилирование регуляторных областей генов-онкосупрессоров происходит на начальных этапах онкозаболеваний. В современной литературе описаны наборы точек метилирования ДНК, специфичных для большинства типов опухолей. Эти эпигенетические маркеры детектируются в биопсийном материале, а также в плазме крови, моче и других биологических жидкостях. Все это позволяет использовать эпигенетические маркеры для диагностики и мониторинга онкопатологий в рутинной клинической практике.
В настоящей работе впервые применен метод диагностики онкологических заболеваний, основанный на использовании новой запатентованной GLAD-ПЦР-технологии (Патент РФ № 2525710). Внедрение этого метода позволит значительно увеличить чувствительность эпигенетической онкодиагностики, сократить время анализа и снизить его стоимость.
Описание исследования

Аберрантное метилирование регуляторных областей генов-онкомаркеров показано для большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, которые в среднем составляют более 90% всех случаев злокачественных новообразований. Аберрантным (аномальным) считается локальное гиперметилирование отдельных участков ДНК, так называемых CpG-островков, в регуляторных областях генов-онкосупрессоров, которые в норме лишены метильных групп. В раковых клетках гиперметилирование de novo происходит благодаря активности ДНК-метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt3b, которые распознают и метилируют последовательность RCGY, превращая ее в последовательность R(5mC)GY (здесь и далее 5mC - 5-метилцитозин). ДНК эндонуклеаза GlaI, в свою очередь, способна распознавать только метилированные сайты RCGY, на основании чего был разработан метод GLAD-ПЦР (Патент РФ № 2525710). Определение метилированных участков происходит последовательно в три этапа: гидролиз, лигирование, ПЦР. Гидролиз образца ДНК метилзависимой эндонуклеазой GlaI по специфическому сайту R(5mC)GY, позволяет фиксировать наличие метилирования в анализируемых участках. Лигирование адаптера (специально подобранного универсального олигонуклеотидного дуплекса) – промежуточный шаг, закрепляющий точку расщепления ДНК для проведения дальнейшего ПЦР. Амплификация метилированной ДНК происходит с помощью гибридного праймера, частично комплементарного последовательности пришитого адаптера, с одной стороны, и второго праймера соответствующего участку геномной последовательности с другой. Специфическая ПЦР, в таких условиях, может происходить только при успешном прохождении первых двух стадий, что в свою очередь возможно только при наличии метилирования в исходном анализируемом участке выбранного гена. ПЦР в режиме реального времени с использованием флюоресцентно-меченого зонда устраняет необходимость проведения электрофоретического разделения продуктов амплификации и дает возможность сравнительной оценки количества метилированных молекул ДНК.

Первоначально нами были исследованы участки 23 генов-онкомаркеров ассоциированных с колоректальным раком. Метилированные сайты RCGY были определены на модели клеточной линии колоректальной аденокарциномы SW837. ДНК, выделенные из образцов донорских тканей колоректальной аденокарциномы и образцов нормальных тканей слизистой прямой кишки, в количестве 21 и 9 соответственно, были проанализированы методом GLAD-ПЦР. В целом, данные полученные для донорских образцов подтвердили преобладание в онкогических образцах метилированных сайтов RCGY во всех исследуемых генах. Образцы здоровой ткани показали полное отсутствие метилирования для генов SDC2, FBN1(3.3), FBN1(3.1), SEPT9, THBD и VIM. Однако в случае с генами EID3 и ESR1 было обнаружено, что часть образцов здоровых тканей все же была метилирована, а для генов TMEFF2 и SOX17 в норме оказались метилированы все 9 образцов. Более точную оценку диагностической значимости выявленных маркерных сайтов проводили при помощи статистического ROC-анализа полученных данных, интегральным показателем которого служит площадь под ROC-кривой (ППК), определяемая чувствительностью и специфичностью теста.

Для дальнейшей работы по созданию сигнатуры, пригодной для клинической диагностики колоректального рака, нами были отобраны гены-кандидаты с показателем ППК > 0.8: ADHFE1, CNRIP1, FBN1, SEPT9 и UCHL1. GLAD-ПЦР-анализ наличия метилирования в регуляторных районах этих генов проводился на образцах свободноциркулирующей ДНК из крови, полученных от 200 человек с подтвержденным диагнозом колоректального рака и 200 здоровых доноров. Для оценки диагностической значимости отдельных эпигенетических маркеров и суммарной сигнатуры на данной выборке использовали ROC-анализ, результаты которого отражены в таблице.

Ген-онкомаркер

Чувствительность, %

Специфичность,

%

ППК

Стандартная ошибка

95% доверительный интервал

ADHFE1

57

89

0,705

0,027

0,658–0,749

CNRIP1

73

84

0,809

0,022

0,767–0,847

FBN1

60

85

0,745

0,025

0,699–0,787

SEPT9

68

87,5

0,772

0,024

0,727–0,812

UCHL1

58,5

84

0,692

0,027

0,644–0,737

Суммарная сигнатура

83,5

91

0,938

0,011

0,910–0,960

Из таблицы видно, что показатели для отдельных маркеров недостаточны для точной диагностики колоректального рака, тогда как суммарная сигнатура обладает высокой чувствительностью и специфичностью (>80% и >90% соответственно). На базе этих маркеров может быть создана эпигенетическая тест-система, пригодная для использования в любой ПЦР-лаборатории.

Результаты исследования

Многочисленные исследования в области медицинской эпигеномики уже позволили разработать ряд способов эпигенетической ДНК-диагностики некоторых онкологических заболеваний. Так, в 2008-2012 годах в компании Epigenomics AG (Германия) были разработаны тест-системы для диагностики колоректального рака на основе выявления специфического эпигенетического маркера mSEPT9 в периферической крови (Epi proColon) и диагностики рака легких на основе выявления эпигенетического маркера mSHOX2 в бронхиальном секрете (Epi proLung). Для детекции маркеров метилирования зарубежные производители, как правило, используют методы, основанные на бисульфитной конверсии цитозиновых оснований, которые, однако, имеют ряд существенных недостатков. Среди них: 1) неполнота конверсии, что может приводить к ошибочным результатам анализа; 2) значительные потери ДНК на этапе конверсии; 3) методы являются ресурсоемкими. Все это негативно сказывается на качестве и стоимости проводимой диагностики. Альтернативные методы, основанные на использовании метил-связывающих белков для изоляции метилированной ДНК и ее последующей амплификации (например, технология MethylMeter, разработанная специалистами американской компании «RiboMed»), позволяют достигать высоких показателей чувствительности/специфичности и используются производителями некоторых тест-систем (например, G-CIMP DecisionDX от «Castle Biosciences», США). Тем не менее, они остаются весьма трудоемкими, а для четкого количественного анализа результатов требуется сложное дорогостоящее оборудование. В результате, минимальная стоимость одного эпигенетического ДНК-теста составляет не менее 150 евро.

Фементативные методы, основанные на расщеплении ДНК метилчувствительными и/или метилзависимыми эндонуклеазами, являются гораздо более простыми и в то же время достаточно чувствительными. В частности, в ряде методик эпигенетической диагностики для детекции маркеров метилирования используются метил-чувствительные эндонуклеазы рестрикции. Однако данный подход не позволяет выявлять частично метилированную ДНК, тогда как именно такой паттерн метилирования CpG-островков характерен для самых ранних стадий канцерогенеза. Это накладывает значительные ограничения на чувствительность теста.

Полученная нами сигнатура эпигенетических онкомаркеров для диагностики колоректального рака методом GLAD-ПЦР позволяет идентифицировать метилирование эпигенетических онкомаркеров уже на начальных стадиях возникновения нарушений функциональной активности генов с показателями чувствительности и специфичности (83% и >91% соответственно). Нами показана эффективность сигнатуры при анализе метилирования генов-онкомаркеров колоректального рака в образцах свободноциркулирующей ДНК крови. Преимущества использования GLAD-ПЦР-анализа, а именно: нечувствительность метода к примеси неметилированной ДНК, высокая специфичность реакции, отсутствие специальных требований к квалификации исполнителя, а также не превышающее 6 часов время анализа и низкая стоимость исследования, делают весьма привлекательной разработку диагностической системы и вывод ее на рынок.

В дальнейшем, полученные результаты могут быть использованы в молекулярно-генетической диагностике других онкопатологий, а также для оценки эффективности противораковой терапии.

Практическая значимость исследования
Поскольку мировой рынок эпигенетической диагностики еще только формируется, передовые разработки и внедрение новых продуктов для эпигенетической диагностики необходимы российским компаниям-производителям, чтобы впоследствии занять прочные позиции на этом рынке как в России, так и в мире.