Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0020

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0020
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Название доклада
Разработка автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций (гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунодефицита, цитомегаловирусной инфекции, сифилиса и токсоплазмоза) в препаратах крови
Докладчик
Филатов Павел Владимирович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта: Разработка простого в применении, полностью укомплектованного и автономного набора для одновременного выявления в образцах крови антител к 6 возбудителям наиболее значимых гемотрансмиссивных инфекций (ГТИ).
Задачи проекта: Подбор совместимых материалов и иммунокомпонентов для создания набора, разработка и изготовления уникального оборудования для автоматизации наиболее трудоемких операций изготовления набора, создание экспериментального стенда и отработка на нем технологии производства набора, оптимизация условий выполнения мультиплексного анализа, изготовление и испытания экспериментальных образцов набора, подготовка научно-технической документации для регистрации набора и рекомендаций для индустриального партнера по использованию полученных результатов.
Актуальность и новизна исследования
Заболеваемость ГТИ представляет и медицинскую и социальную проблему. Наиболее значимыми ГТИ являются: гепатиты В и С; ВИЧ 1/2 и сифилис, а для доноров крови и органов имеют значение цитомегаловирусная инфекция и токсоплазмоз. Эти ГТИ широко распространены, часто не имеют специфичных симптомов и встречаются в форме «микст-инфекций». Важным элементом борьбы с ГТИ является их раннее обнаружение путем первичного тестирования у доноров и у групп населения с повышенным риском заражения. В настоящее время такое тестирование проводится в специализированных лабораториях с использованием ряда тестов и представляет собой длительную и дорогую процедуру. Особую проблему подбор донора и оценка риска заражения ГТИ при хирургических вмешательствах представляет при оказании экстренной медицинской помощи, а также в удаленных населенных пунктах.
Мультиплексная иммунодиагностика – новое направление, предполагающее одновременное определение множества различных антигенов или антител. За рубежом разработка иммуночипов направлена на выявление множества белков на миниатюрных подложках, роботизации процесса изготовления и применения чипов. Такой подход в настоящее время далек от внедрения в широкую клиническую практику.
В нашем проекте реализован другой подход, сочетающий мультиплексность с простотой изготовления и применения иммуночипов. Создан автономный, простой в применении и недорогой тест на основе плоских белковых матриц для одновременного выявления 6 серологических маркеров ГТИ, который может значительно облегчить проведение первичного тестирования, сделать его более оперативным, дешевым и доступным для пациентов.
Аналогов предлагаемого теста нет ни в России, ни за рубежом.
Описание исследования

Основными элементами набора являются белковые матрицы (иммуночипы) и аналитические ванны. Матрицы изготовлены из синтетической бумаги блоками в виде гребня с 5 зубцами, каждый из которых является иммуночипом. На него дискретно пятнами по 2 мм нанесены антигены ГТИ и контроль работоспособности системы. Аналитические ванны изготовлены из полипропилена и содержат 5 стрипов по 12 ячеек в каждом. Ячейки заполнены готовыми рабочими растворами и герметизированы фольгой.

Методология применения иммуночипов представляет собой дот-иммуноанализ с применением конъюгатов на основе коллоидного золота и каталитическим усилением оптического сигнала. Процедура выполнения анализа заключается в переносе иммуночипа с определенными временными интервалами по рядам ячеек аналитической ванны. Она проста, реализуется в течение не более 70 мин при комнатной температуре и не требует особой квалификации оператора. Размеры гребенки и ванны сопоставимы, что позволяет одновременно исследовать 5 образцов, или, отрезав один зубец, проводить индивидуальное обследование. Учет осуществляется визуально по наличию темных пятен в местах нанесения определенных антигенов. Полуколичественный учет может выполняться инструментально путем обработки оцифрованного изображения матрицы специальной компьютерной программой.

Результаты исследования

Экспериментально обоснован выбор синтетической бумаги и способа изготовления из нее подложек белковых матриц. Исследованы целевые свойства антигенов возбудителей ГТИ от разных производителей и подобраны условия их иммобилизации на поверхности подложки. Проведена сравнительная оценка вторичных иммунокомпонентов. Отработаны способ получения стабильного в течение года конъюгата на основе коллоидного золота и процедуры приготовления и применения проявляющей системы, обеспечивающие  выявление до 10 пг антител, нанесённых на подложку с динамическим диапазоном от 1,2 нг до 10 пг IgG.

Создана рабочая панель из 24 сывороток, содержащих маркеры ГТИ в разных сочетаниях и концентрациях. Проведена оптимизация условий применения набора, разработана инструкция по его применению. Разработана компьютерная программа для учета, обработки и хранения результатов мультиплексного дот-иммуноанализа

Разработаны и изготовлены уникальные автоматические устройства для нанесения антигенов на подложку белковой матрицы и заполнения растворами ячеек аналитических ванн. Создан экспериментальный стенд для отработки технологии производства наборов, обеспечивающий производительность около 60 000 наборов (240 000 анализов) в год. Определены материальные расходы на изготовление 1 набора - 366 руб. (18 руб. на 1 мультиплексный анализ). Подготовлен лабораторный регламент на производство и проект технических условий на набор. Изготовлены 5 серий экспериментальных образцов набора «ГТИ-спектр-IgG-антитела» общим объемом 200 шт.

Проведены лабораторные испытания наборов, показавшие их соответствие проекту технических условий. Чувствительность и специфичность определения всех маркеров ГТИ при анализе рабочей панели образцов предприятия составила 100 %. Расчеты на основе ускоренной оценки стабильности показали, что ожидаемый срок годности набора составляет 660 дней. Оценка стабильности в реальных условиях хранения не выявила ухудшения качества наборов в течение 9 мес. хранения при 4 о С. Показано, что экспериментальные образцы набора адекватно определяют образцы контрольных панелей сывороток, результаты дот-анализа хорошо коррелируют с данными ИФА. Получены положительные отзывы при апробации экспериментальных образцов набора в диагностических лабораториях России, Казахстана, Кыргызстана и Таджикистана.

Проведены маркетинговые исследования, показавшие перспективы сбыта набора в объеме около 1 млн. анализов в год, что почти в 4 раза превышает  производительность линии по изготовлению наборов. Разработаны ТЗ и ТЭО  на организацию производства наборов на базе промышленных площадей индустриального партнера – ЗАО «ИмДи».

Таким образом, создан набор для мультиплексного анализа, чувствительность и специфичность которого не уступают показателям планшетного варианта ИФА, при этом дот-анализ имеет по сравнению с ним явные преимущества по простоте, оперативности и стоимости анализа. Однако основным достоинством анализа на белковых матрицах является его автономность и возможность выполнения в небольших не имеющих специального оборудования и высококвалифицированного персонала медицинских пунктах, в приемном покое, у постели больного или в частной практике.

Способ анализа, состав набора и ряд технологических приемов его изготовления защищены 6 патентами РФ.

Практическая значимость исследования
Набор «ГТИ-спектр-IgG-антитела» предназначен для комплексного выявления антител к шести возбудителям основных гемотрансмиссивных инфекций в лабораторных и внелабораторных условиях. Набор полностью укомплектован и автономен, выполнение анализа не требует оборудования, энергообеспечения и высокой квалификации оператора. Такие наборы могут быть использованы в медицинской диагностике и санитарно - эпидемиологическом контроле, а также при обследовании доноров и оценке риска для персонала при хирургических вмешательствах. Наиболее перспективной сферой применения наборов может быть их использование при проведении экстренных хирургических и акушерских вмешательств, когда оперативный анализ в диагностической лаборатории затруднен или недоступен. Внедрение набора в клиническую практику позволит сделать первичное тестирование ГТИ более простым, а также сократить время и стоимость комплексного анализа
Относительная простота и дешевизна изготовления наборов в совокупности с их высокими экспуатационными характеристиками позволят наладить их быстрый выпуск индустриальным партнером - ЗАО «ИмДи» (Новосибирск) и стимулировать спрос конечным потребителем. Стратегия сбыта наборов, предусматривает первичный вывод набора на рынки Сибирского ФО с последующим подключением других регионов РФ и стран ближнего зарубежья.
В России потребность в рынке в комплексных анализах ГТИ составляет около 25 млн./год, в том числе около 1 млн./год исследований по экстренным показаниям. Предполагаемая экономическая эффективность от замены 10 % российского рынка экстренных анализов на мультиплексные наборы ежегодно составит около 100 млн. руб.