Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0058

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0058
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук
Название доклада
Разработка аппаратно-методического комплекса для нано- и микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих с использованием фемтосекундных и непрерывных лазеров с излучением в окне прозрачности биологической ткани
Докладчик
Надточенко Виктор Андреевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Основной проблемой, на решение которой направлен проект, является разработка приборов и технологий для нано- и микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих, минимизирующих негативные воздействия на эти эмбрионы, применимых в медицинских клиниках и для нужд сельского хозяйства. Целями проекта являются развитие принципиально новой технологии и разработка необходимого материально-технического оснащения для проведения высокоэффективной минимально инвазивной нанохирургии эмбрионов млекопитающих с использованием фемтосекундных и непрерывных лазеров с излучением в ближнем ИК диапазоне в окне прозрачности биологической ткани, а также разработка на основе этой технологии методов получения генетически модифицированных доимплантационных эмбрионов млекопитающих.
Актуальность и новизна исследования
Высокая актуальность выполнения проекта обусловлена важностью задач, прежде всего – медицинских, решение которых становится возможным при введении в клиническую практику разрабатываемых систем. С развитием эмбриологии и биологии стволовых клеток, а также медицинских приложений этих наук, крайне важно иметь достаточно гибкий, точный и безопасный инструментарий для работы с одиночными клетками. Следует заметить, что, как показывают патентные исследования, планируемый к разработке комплекс соответствует мировому уровню техники, а по ряду параметров превосходит известные образцы, в частности, в области мультиплексирования лазерного пучка и применения многоскальпельных/многопинцетных техник. Своевременная разработка подобных лазерных систем важна для недопущения технологического отставания от ведущих западных стран.
Описание исследования

В ходе выполнения четвертого этапа прикладной научно-исследовательской работы по теме «Разработка аппаратно-методического комплекса для нано- и микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих с использованием фемтосекундных и непрерывных лазеров с излучением в окне прозрачности биологической ткани», выполняемой в рамках исполнения обязательств по Соглашению № 14.604.21.0058 от 27.06.2014 г., выполнены все работы, предусмотренные Планом-графиком исполнения обязательств, с соблюдением требований Технического задания.

 

Успешно проведены испытания экспериментального образца комплекса фемтосекундной лазерной нанохирургии (ЭО КФЛНХ) - экспериментальный образец удовлетворяет всем требованиям ТЗ и ПиМ испытаний. Изучены различные аспекты состояния и выживаемости биологических объектов после манипуляций, выполненных с помощью ЭО КФЛНХ, скорректирована стратегия лазерных манипуляций с эмбрионами. Произведена конструктивная доработка КФЛНХ и создана итоговая ЭКД на ЭО КФЛНХ, включая проект
руководства по эксплуатации. На основе результатов манипуляций, выполненных на эмбрионах мыши с помощью ЭО КФЛНХ, разработана методика слияния бластомеров в эмбрионах мыши. Проведены дополнительные патентные исследования по теме проекта.
Разработаны методики получения химерных бластоцист и чистой линии. Производится экспериментальная апробация методик.

Результаты исследования

Перфорация блестящей оболочки

Схемы перфорации зоны пеллюцида.

Применяли следующие схемы перфорации:

  • утончение блестящей оболочки,
  • единичная лазерная перфорация,
  • множественная лазерная перфорация.

 

Полученные результаты по перфорации можно суммировать как:

  • После проведения единичной перфорации вероятность развития эмбрионов до стадии бластоцисты соответствовал заявленному (не менее 80%).
  • Оптоперфорация не влияет на способность эмбрионов развиваться до стадии бластоцисты, однако не увеличивает % выхода эмбрионов из блестящей оболочки (за исключением случая, когда опыт проводили на старых мышах).
  • Оптоперфорация снижает % выхода эмбрионов из оболочки и их жизнеспособность, если она проводилась на стадии бластоцисты: в этом случае воздействие на оболочку затрагивает и материал эмбриона, повреждая его.
  • Было показано, что множественная перфорация снижает % выхода эмбрионов из оболочки, поскольку эмбрион пытается использовать для выхода оба отверстия одновременно, и в итоге остается в оболочке.

 

Продемонстрирована возможность слияния бластомеров в эмбрионе на стадиях 2, 4 и 8 клеток.

В случае слиния в эмбрионах 4х и 8х клеток основные моменты методики слияния состояла в следующем:

  • В поле микросокпа лазерное пятно прицеливали в точку контакта двух бластомеров.
  • Проводили оптоперфорацию двух бластомеров в области контакта последовательно, первой пары, второй пары и т.д.

 

  • Оптоперфорация проводится вблизи пороге образования кавитационного пузырька.
  • Лазерное пятно фемтосекундного лазера фокусировали в другую точку контакта – точку контакта слитой клетки и еще не слитого эмбриона.


Уникальность проводимых операций состоит в том, что с помощью комплекса КФЛНХ удается получать эмбрионы в которых содержатся эмбрионы с двумя, тремя ядрами в одном бластомере. Подобное слияние недостижимо никакими альтернативными методами слияния. Только этим методом можно получить подобные эмбрионы содержащие как ди- так и полиплоидные клетки бластомеров.

 

Таблица 3.3.1 Схема слияния бластомеров в КФЛНХ на стадии развития эмбрионов с несколькими клетками.

Количество эмбрионов, участвующих в операции

Исход слияния

Слитые/общее количество

 

Тип слияния

 

21

13/21~61%

 

Слияние в 4х клеточных эмбрионах 1-й пары бластомеров

 

26

14/26~54%

 

Слияние в 4х клеточных эмбрионах двух пар бластомеров

 

36

19/36 ~50%

 

Слияние в 4х клеточных эмбрионах 3х бластомеров и 1 бластомер не затронут

 

12

5/12~42%

 

Слияние в 8-ми клеточных эмбрионах одной пары бластомеров 

 

11

4/11~31%

 

Слияние в 8-ми клеточных эмбрионах 2х пар бластомеров 

 

 

Практическая значимость исследования
Получение индивидуальных эмбриональных стволовых клеток млекопитающих на сегодняшний день является практически важной задачей современной биомедицины. Индивидуальные эмбриональные стволовые клетки млекопитающих обладают способностью дифференцироваться в любые клетки организма. Для создания клонированного эмбриона сегодня применяются инвазивные методы: электрослияние, механическое извлечение ядра микропипетками и химические подходы. Именно из-за инвазивности этих методов эффективность клонирования остается весьма низкой.
В последнее время стало ясно, что для эффективной нано - и микрохирургии требуется использование фемтосекундных лазеров. Лазерные импульсы фемтосекундной длительности позволяют эффективно осуществлять многофотонные процессы поглощения света даже при низкой энергии импульса. В результате многофотонного поглощения образуются высоковозбужденные молекулы, в которых происходят различные физико-химические процессы, ведущие к распаду молекул и деструкции материала. Это позволяет использовать его в качестве оптического скальпеля. Принципиальной особенностью фемтосекундных импульсов является то, что процессы под их воздействием можно осуществлять с минимальным разогревом. Появились работы по применению фемтосекундных импульсов для микрохирургии клеток, тканей и эмбрионов . Сфокусированный лазерный пучок действует на мезоскопический объект в поле фокуса пучка часто называют оптической ловушкой. Все исследования, использующие многофотонное поглощение выполнены с использованием единичного фемтосекундного светового пучка (фемтосекундная ловушка), т.е с единичным «оптическим скальпелем». В настоящее время, разрабатываются также методы неинвазивной микрохирургии ранних эмбрионов млекопитающих с применением фемтосекундных лазерных импульсов.