14.604.21.0068

Цели исследования.
1) Разработать метод конкурентного иммуноферментного анализа на клетках для определения содержания аутоантител к β1-адренорецептору.
2) Создать лабораторный прототип диагностического набора для определения аутоантител к β1-адренорецептору в сыворотке крови пациентов.
3) Определить содержание аутоантител к β1-адренорецептору, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, в группах пациентов с дилатационной кардиомиопатией, с нарушениями ритма и проводимости сердца и с ишемической болезнью сердца в сравнении с группой здоровых добровольцев.

Задачи исследования.
а) Провести отбор и клиническое обследование групп пациентов, сформировать банк биообразцов и базу данных.
б) Получить линию клеток, стабильно экспрессирующих на своей поверхности рекомбинантный β1-адренорецептор человека.
в) Разработать метод иммобилизации клеток на планшете для ИФА.
г) Получить линии клеток-продуцентов мышиного и химерного (мышь/человек) рекомбинантных антител ко второй внеклеточной петле β1-адренорецептора, наработать и очистить препараты рекомбинантных антител.
д) Оптимизировать условия и отработать методику определения аутоантител к β1-адренорецептору.
е) Провести измерения содержания аутоантител к β1-адренорецептору в собранных биообразцах при помощи разработанного метода, а также методом стандартного ИФА с использованием пептидов, проанализировать и сравнить полученные результаты.

Аутоантитела к β1-адренорецептору могут вносить существенный вклад в патогенез ряда сердечно-сосудистых заболеваний, в первую очередь, дилатационной кардиомиопатии. Устойчивая стимуляция локализующихся в сердечной мышце β1-адренорецепторов циркулирующими в организме аутоантителами-агонистами оказывает кардиотоксическое действие, которое в конечном счете может приводить к хронической сердечной недостаточности и преждевременной смерти. Своевременное выявление аутоантител-агонистов у некоторых категорий больных должно служить обоснованием применения терапевтической иммунокоррекции (удаление аутоантител методом плазмафереза, иммуномодулирующая терапия), а периодический мониторинг уровня аутоантител к β1-адренорецептору позволит оценивать эффективность лечения у конкретного больного.
Существующие методы определения аутоантител-агонистов с использованием пептидных фрагментов β1-адренорецептора имеют недостаточную эффективность по причине высокой конформационной чувствительности природных аутоантител. Поэтому, несмотря на очевидную потребность, в настоящее время соответствующие диагностические наборы в распоряжении клиницистов отсутствуют. Необходима разработка новых подходов в соответствии с требованиями рутинной клинической практики. Перспективным направлением является создание иммунологических методов анализа с использованием клеток, экспрессирующих рекомбинантный β1-адренорецептор, в качестве носителя антигена в его природной конформации.

Проведена оптимизация и осуществлен синтез гена β₁‑адренорецептора человека. Оптимизированный ген встроен в бицистронный плазмидный вектор, сконструированный для эффективной экспрессии генов в клетках млекопитающих. Методом стабильной трансфекции получена линия клеток ADL-7A, экспонирующих на своей поверхности около 2 млн молекул рекомбинантного β₁-адренорецептора. Мониторинг содержания β₁‑адренорецептора в клетках ADL-7A методом радиолигандного анализа продемонстрировал стабильность экспрессии трансгена на протяжении 42-суточного периода культивирования.

Подобраны оптимальные условия и отлажена методика иммобилизации клеток млекопитающих на планшете для ИФА. Для улучшения прикрепления клеток применена обработка поверхности планшетов поли-L-лизином. В качестве фиксирующего агента выбран глутаровый альдегид в концентрации 0,025%. Дополнительная обработка клеток этаноламином и боргидридом приводит к существенному улучшению сохранности нативной структуры антигена.

Синтезированы гены тяжелых и легких цепей рекомбинантного мышиного и химерного (мышь/человек) антител, направленных ко второй внеклеточной петле β₁‑адренорецептора. Гены  встроены в оригинальный двухкассетный вектор pDC. Проведена трансфекция и получены линии клеток, продуцирующие мышиное и химерное рекомбинантные антитела. Антитела произведены и очищены из кондиционированной бессывороточной среды хроматографией на гидрофобном и аффинном сорбентах. Электрофоретический и спектрофотометрический анализы подтвердили чистоту и целостность препаратов антител. Продемонстрировано эффективное связывание рекомбинантных антител с пептидом β8, соответствующим аминокислотной последовательности второй внеклеточной петли β₁-адренорецептора.

Определены константы реакции связывания рекомбинантных антител с β₁‑адренорецептором и оптимизированы параметры методики конкурентного иммуноферментного анализа на клетках: формат проведения анализа, количество клеток в лунке планшета, состав блокирующего раствора, время инкубации, условия реакции с антителами-конкурентами, тип и степень разведения коньюгата. Установлено, что мышиное и химерное антитела способны конкурировать друг с другом за связывание с антигеном. Это позволило использовать препарат химерных антител в качестве калибровочного стандарта. Подобран стандарт сыворотки человека для добавления к калибровочным препаратам химерных антител. Собран полный комплект компонентов, составлен проект инструкции и изготовлен лабораторный прототип диагностического набора для определения уровня аутоантител к β₁‑адренорецептору в сыворотке крови пациентов. На модельной системе продемонстрирована возможность измерения концентрации аутоантител в диапазоне от 5 нг/мл до 50 нг/мл.

Сформированы 4 группы пациентов: с дилатационной кардиомиопатией воспалительного генеза (40 человек), с желудочковыми нарушениями ритма сердца идиопатического характера (45 человек), с ишемической болезнью сердца и нарушениями ритма сердца (40 человек), с ишемической болезнью сердца без нарушений ритма сердца (15 человек). Также собрана контрольная группа здоровых добровольцев (19 человек). Всем лицам, отобранным в исследование, в соответствии с  протоколом проведено комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследование и измерено содержание аутоантител к β₁‑адренорецептору разработанным методом конкурентного ИФА на клетках и стандартным ИФА с использованием пептидов.

Метод конкурентного иммуноферментного анализа на клетках для определения содержания аутоантител к β₁-адренорецептору опробован на образцах сыворотки крови  пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы нескольких категорий в сравнении с группой здоровых добровольцев. Продемонстрировано повышенное содержание аутоантител в группе больных дилатационной кардиомиопатией (62% пациентов), что близко к результатам аналогичных работ других авторов и свидетельствует о перспективности применения данного метода в клинической диагностике с целью установления аутоиммунной природы конкретного заболевания.

Полученные результаты подтверждают точку зрения ряда авторов об ограничениях технологии ИФА с пептидами как основного метода определения аутоантител к β₁-адренорецептору. По нашим данным, частота встречаемости достоверно положительных сигналов стандартного ИФА с пептидами даже в группе больных дилатационной кардиомиопатией не превышает 10%.

Зарегистрировано пониженное содержание аутоантител к β₁-адренорецептору, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, у пациентов с идиопатическими желудочковыми нарушениями ритма сердца, что указывает на связь этого заболевания с определенными изменениями аутоиммунного статуса организма. Для выяснения характера этой связи требуются дополнительные исследования.

Существенных отличий в распределении содержания аутоантител для групп пациентов с ишемической болезнью сердца, как сопровождаемой нарушениями ритма сердца, так и при их отсутствии, по сравнению с группой здоровых добровольцев, не обнаружено. Это согласуется с представлениями о малой роли аутоиммунных реакций в развитии заболеваний данного типа.

   

Показана принципиальная возможность применения разработанного метода для диагностирования аутоантител к β1-адренорецептору у пациентов с различными заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Полученные результаты позволяют перейти к опытно-конструкторскому этапу создания коммерческой диагностической иммуноферментной тест-системы, обладающей высокой патентоспособностью и конкурентноспособностью на российском рынке. Ее введение в клиническую практику приведет к положительному экономическому эффекту за счет уменьшения расходов на обследование и лечение социально-значимой категории больных.