Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0117

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0117
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Название доклада
Разработка тест-систем для идентификации структурных перестроек генома опухолевых клеток и молекулярно-генетических характеристик пациента, определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей
Докладчик
Наседкина Татьяна Васильевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Основной целью проекта является повышение эффективности диагностики и лечения острых лейкозов у детей в результате разработки и внедрения высокотехнологичных методов молекулярно-генетического анализа.
Задачи проекта включают разработку методов идентификации молекулярно-генетических маркеров, определяющих выбор персонифицированной терапии при острых лейкозах у детей, и создание тест-систем для определения генетических нарушений в опухолевых клетках и молекулярно-генетических характеристик пациента при острых лейкозах у детей с целью индивидуализации терапии.

Актуальность и новизна исследования
Острые лейкозы - наиболее распространенное онкологическое заболевание детского возраста. Ежегодно в России заболевает различными формами лейкозов около 2000 детей. Лечение лейкозов осуществляется по принципиально различающимся протоколам (различные комбинации цитостатических препаратов, облучение, трансплантация костного мозга), требующим предварительного разделения пациентов на группы риска в зависимости от молекулярных характеристик опухолевых клеток. Однако, несмотря на успехи современной медицины и внедрение передовых технологий лечения, смертность от лейкозов в России составляет около 400 детей в год.
Недостаточная эффективность лечения лейкозов у детей является чрезвычайно актуальной проблемой и складывается из целого ряда ключевых моментов. Основными направлениями решения этой проблемы в данном проекте являются:
1) совершенствование методов идентификации молекулярно-генетических маркеров опухолевых клеток, имеющих принципиальное значение при выборе терапии при острых лейкозах у детей; 2) разработка информативных генетических тестов для прогнозирования ответа на терапию, определение риска развития побочных реакций и тяжелых инфекционных осложнений в ходе лечения на основе генетического анализа.
Новизной проекта является разработка мультиплексных тест-систем для анализа генома опухолевых клеток и для определения генотипа пациента на единой технологической платформе, ориентированной на рутинное использование в практической медицине. Это позволит проводить комплексный молекулярно-генетический анализ с использованием высокотехнологичных подходов как в крупных диагностических центрах, так и в небольших клинических лабораториях.
Описание исследования

Для разработки тест-системы для идентификации химерных генов была сформирована коллекция образцов костного мозга детей с острыми лейкозами до лечения, при ее формировании учитывали результаты морфологического и цитохимического исследования, а также иммунофенотипирования. Для выявления хромосомных перестроек проводили цитогенетическое исследование и анализ на биочипах (с использованием коммерческого набора «ЛК-Биочип»), который позволяет выявлять 12 известных структурных перестроек генома, приводящих к образованию химерных генов. Поиск дополнительных клинически значимых мишеней в образцах проводили с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ и метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров. Для анализа редких перестроек гена MLL использовали длинную инвертированную ПЦР.  Для анализа транскриптома лейкемических клеток методом высокопроизводительного секвенирования  с целью поиска новых химерных генов использовали технологическую платформу Illumina. Данный метод основан на принципе SBS (sequncing-by-synthesis, секвенирование путем синтеза). Пробоподготовка включает мостиковую амплификацию библиотеки на жесткой подложке (BridgePCR), далее происходит определение первичной последовательности, которое осуществляется путем синтеза новой цепи из нуклеотидов, каждый из которых несет отщепляемую флюоресцентную метку своего цвета. Поиск химерных генов проводили с использованием программы DeFuse. Наличие выявленных химерных транскриптов подтверждали методом ОТ-ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру.

При разработке метода идентификации структурных перестроек генома (химерных генов)  использовали опыт создания тест-системы  на основе технологии гидрогелевых биочипов. Метод включает пробоподготовку в виде ОТ-ПЦР и последующую гибридизацию на биочипе.  Использование новых методических и технологических решений, таких как, разработка специфичных праймеров для реакции обратной транскрипции, разработка процедуры одноэтапной ПЦР с использованием составных праймеров, содержащих специфическую последовательность и универсальный адаптор, повышение уровня мультиплексности реакций, использование новых флуоресцентных красителей, позволило сократить время анализа, повысить его производительность и аналитическую чувствительность. Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе, праймеры для обратной транскрипции и праймеры для проведения ПЦР  сконструированы с помощью программ PrimerPremier 5 и Nucleotide-nucleotideBLAST. Уровень экспрессии химерных транскриптов в образцах коллекции для определения аналитической чувствительности тест-системы для идентификации химерных генов определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Биочипы для проведения исследовательских испытаний изготавливали методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля.

Поиск информативных маркеров в генах иммунного ответа, определяющих риск развития тяжелых инфекционных осложнений у детей с лейкозами, осуществляли методом высокопроизводительного таргетного секвенирования на приборе GS Junior по технологии 454 (Roche). Для целевого исследования генома в пределах интересующих регионов генов иммунного ответа и отбора последовательностей по технологии NimbleGen EZSeq Capture нами была разработана панель зондов Immuno Project, включающая кодирующие участки генов NOD2, NLRP3, STAT1, STAT3, CARD9, IL10, IL17RA, IL12RB1, IL1A, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, PTPN22, IL7R, IL7, MYD88. Для биоинформационного анализа результатов таргетного секвенирования с использованием технологии NGS использовали картирование прочтений на референсный геном. Результаты верифицировали секвенированием по Сэнгеру. При разработке тест-системы для  идентификации полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и в генах иммунного ответа использовали комбинацию одноэтапной ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе. Использование составных праймеров, включающих специфическую часть для амплификации интересующих участков генов и универсальный адаптор, позволило добиться высокой степени мультиплексности  ПЦР и эффективного флуоресцентного маркирования ампликонов. Биочипы изготавливали методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля. Для верификации работы сформирована коллекция контрольных образцов ДНК пациентов с известными генотипами, которые были определены секвенированием по Сэнгеру.

Результаты исследования

Сформирована коллекция из 100 клинических образцов костного мозга детей с острыми лейкозами до лечения. Образцы охарактеризованы (цитогенетическое исследование, иммунофенотипирование, анализ на биочипах). Цитогенетически в образцах обнаружен широкий спектр хромосомных перестроек – 24 аберрации, приводящие к образованию химерных генов (у 80% пациентов), а также гиперплоидия (у 10% пациентов). В образцах коллекции выявлены клинически значимые перестройки с участием гена MLL: t(1;11) (p32;q23)MLL-EPS15; 1;11)(q21;q23)MLL-MLLT11.  В результате анализа транскриптома опухолевых клеток при лейкозах у детей с использованием высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina выявлены редкие химерные транскрипты (MLL-SEPT6, OAZ1-PTMA, ETV6-MECOM), которые представляют интерес для дальнейшего изучения как потенциальные диагностические маркеры.  На основе этих исследований разработана панель из 22 наиболее информативных маркеров опухолевых клеток, определяющих подтипы заболевания, выбор терапии и прогноз: ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; MLL/AFF1; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1; MLL/MLLT3; CBFB/MYH11; MLL/MLLT10; MLL/MLLT1; SIL/TAL1; MLL/MLLT4; NPM1/ALK; TCF3/HLF; MLL/ELL; MLL/EPS15; PICALM/MLLT10; MLL/MLLT11; DEK/NUP214; RBM15/MKL1; FUS/ERG. Разработан метод анализа химерных генов на основе комбинации обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и аллель-специфичной гибридизации на биочипе. Разработана эскизная конструкторская документация (ЭКД) на макет тест-системы для идентификации химерных генов. Проведены исследовательские испытания макета тест-системы по разработанной Программе и методикам. Макет тест-системы позволяет выявлять 1 опухолевую клетку среди 10000 нормальных клеток в клиническом образце, специфичность анализа составляет не менее 95%. Разработаны лабораторный технологический регламент изготовления макета тест-системы, проект инструкции по применению, методика идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) в опухолевых клетках при острых лейкозах.

 Получены новые данные о роли аллельных вариантов генов иммунного ответа в развитии тяжелых инфекционных осложнений в ходе терапии при лейкозах у детей. При массовом параллельном секвенировании экзонов 17 генов иммунного ответа с использованием технологической платформы GS Junior/454 (Roche) у 36 пациентов с тяжелыми инфекционными осложнениями в ходе терапии выявлено более 212  однонуклеотидных замен, приводящих к замене аминокислоты, в том числе, PTPN22 с.1858С>Т, TLR4 c.896 A>G и c.1196 C>T, IL7R c.197T>C и c.412G>A. На основании данных секвенирования и анализа генетических баз данных выбраны информативные маркеры в генах метаболизма лекарственных препаратов и в генах иммунного ответа, определяющих чувствительность к терапии и риск развития тяжелых осложнений у детей с лейкозами. Разработана ЭКД на макет тест-системы. Разработана Программа и методики исследовательских испытаний макета тест-системы. По результатам испытаний точность определения генотипа с использованием макета тест-системы составляет не менее 99%. Разработаны лабораторный технологический регламент изготовления макета тест-системы, проект инструкции по применению, методика идентификации аллельных вариантов генов иммунного ответа и генов метаболизирующих ферментов.

Полученные в ходе выполнения проекта результаты соответствуют мировому уровню исследований.

Практическая значимость исследования
Областью применения результата являются онкогематология, клиническая диагностика, педиатрия, биомедицина. Результаты работы могут быть использованы в дифференциальной диагностике и выборе терапии у детей с острыми лейкозами для оптимизации диагностических и лечебных мероприятий. Разрабатываемые тест-системы могут быть использованы в диагностических лабораториях медицинских центров, также они представляют интерес для проведения научных исследований в области онкологии и онкогематологии. Разработанные макеты тест-систем могут быть доведены до стадии коммерческой разработки и производства на базе ООО «БИОЧИП-ИМБ», которое принимает участие в со-финансировании проекта. Заинтересованность в результатах связана с перспективой коммерциализации и последующего производства диагностических наборов. Дальнейшая коммерциализация включает разработку рабочей конструкторской документации, изготовление опытных образцов, проведение технических и медицинских испытаний и получение регистрационного удостоверения. Возможными потребителями результатов проекта являются РОНЦ им. Н.Н.Блохина, ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, специализированные клинические отделения Российской детской клинической больницы (РДКБ), Московской городской детской клинической больницы и других областных и краевых клиник. Поскольку методы молекулярно-генетического анализа являются необходимым этапом клинической лабораторной диагностики лейкозов, а разрабатываемые в настоящем проекте тест-системы имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами молекулярно-генетического анализа, то их востребованность является достаточно обоснованной. Можно прогнозировать достаточно высокий уровень спроса на продукцию в клинической онкогематологии для рутинной клинической диагностики, ввиду постоянного потока пациентов, для которых данный анализ актуален.