Регистрация / Вход
Прислать материал

14.587.21.0026

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.587.21.0026
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)"
Название доклада
Серийная синхротронная кристаллография мембранных белков
Докладчик
Борщевский Валентин Иванович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является развитие научно-технического и технологического комплекса страны в области структурной биологии путем разработки подхода к серийной кристаллографии мембранных белков для получения структур фармакологически важных мембранных белков с использованием набора кристаллов небольшого размера, а также получения структур мембранных белков в активированных состояниях. Выполнение проекта предполагает проведение исследований на базе Европейского центра синхротронного излучения.
Актуальность и новизна исследования
Рентгеновская кристаллография является наиболее важным методом для определения структуры белка. Почти 90% из более чем 95 000 структур в PDB-банке (http://www.rcsb.org) были решены с использованием этого метода. Не смотря на это, стандартный подход к белковой рентгеновской криокристаллографии имеет существенные ограничения.
Важнейшее из таких ограничений - необходимость выращивать достаточно больших и хорошо дифрагирующие белковые кристаллы. Качество дифракции таких кристаллов должно позволять собирать достаточное количество дифракционных данных за время экспозиции кристалла, которое ограничено в силу его радиационного повреждения. К сожалению, невозможность получить большие и хорошо дифрагирующие кристаллы является достаточно распространённой проблемой. Наиболее ярко она проявляется в случае из мембранных белков, многие из которых имеют значительную фармакологическую ценность. В случае невозможности сбора данных с одного кристалла, сбор данных проводят с ряда более мелких кристаллов с последующим объединением дифракционных данных в один полный набор структурных факторов. При таком подходе удается собирать полные наборы дифракционных данных в установленных пределы радиационной дозы. Данный подход приобрёл в последнее время название серийная кристаллография, или, в применении к сбору данных на синхротронных источниках излучения, серийная синхротронная кристаллография. Развитию данных методов посвящен проект.
Описание исследования

В качестве объектов для исследований выбраны представители двух классов мембранных белков:

1. Рецепторы, сопряженные с G-белком. Данный класс белков будет использоваться в работе для апробации сбора данных с небольших кристаллов. В качестве мишеней выбраны два белка. Поскольку процесс наработки белков и их кристаллизации имеет значительные риски, то выбор мишени может быть скорректирован в зависимости от экспериметнлаьных результатов.

Первый из белков – аденозиновый рецептор A2A, представитель пуринергического подсемейства GPCR, отвечает за регулирование кровотока в миокарде за счёт расширения сосудов коронарных артерий, регулирует неадекватно активированные иммунные клетки, модулирует высвобождение некоторых нейротрансмиттеров в мозге. Этот рецептор является главной мишенью кофеина, который является конкурентным антагонистом этого белка. А2А-рецептор имеет относительно высокий уровень экспрессии и стабильности. Это GPCR, для которого была получена структура с самым высоким разрешением (1.8 ангстрем) (Liu et al. 2012, Xu et al. 2011). Таким образом, А2А является хорошей моделью для разработки новых подходов в кристаллографии мембранных белков.

Второй представитель - CysLT1 – человеческий лейкотриеновый рецептор из класса А. Этот рецептор экспрессируется на высоком уровне в селезёнке, лейкоцитах периферической крови, слабее, в гладких мышцах лёгких, бронхах, кишечнике и других тканях. Таким образом активация CysLT1 приводит к бронхоспазму, повышению сосудистой проницаемости, секреции слизи и стимулирует миграцию эозинофилов (Brink et al. 2003). CysLT1 является одним из наиболее важных белков в патогенезе астмы и аллергического ринита. Его антагонисты широко используются в современной медицине в качестве  противоастматических препаратов (Capra et al. 2006). Решение структуры этого белка поможет подобрать более активные и специфические лиганды к этому белку с минимальным количеством побочных эффектов.

2. Мембранные светоактивные белки. Данный класс белков будет использоваться для апробации сбора данных переходных состояний белков при комнатной температуре. В качестве конкретных объектов исследовании выбраны белки - bR и KR2, однако список может корректироваться в зависимости от успеха в наработке белка и его кристаллизации. Данный выбор не случаен. Во-первых, данный класс белков позволяет получать хорошо дифрагирующие кристаллы методом кристаллизации в кубической фазе, который был описан выше (Gushchin et al. 2015, Shevchenko et al. 2014). Во-вторых, рабочий цикл данных белков может быть активирован при помощи облучения лазером, что позволяет проводить сбор дифракционных данных переходных состояний белка. В-третьих, данные объекты представляют важность сами по себе, поскольку является одним из потенциальных "инструментов" для оптогенетического контроля клеток (Deisseroth 2011) - новейшего междисциплинарного направления в биотехнологии, объединяющего молекулярную и клеточную биологию, электрофизиологию, оптику, электронику и генную инженерию. 

Проект предполагает совместное выполнение с Европейским центром синхротронного излучения. При этом на МФТИ лежит функция подготовки необходимых для исследований белковых кристаллов. Европейский центр синхротронного излучения осуществляет организацию и проведения экспериментов по сбору данных с белковых кристаллов. Задача МФТИ разбивается на ряд подзадач:

Первая из них - подготовка генетических конструкций белковых препаратов целевых белков. На этом этапе будет проведена подготовка генов целевых белков для последующей экспрессии.

Вторая задача проекта - экспрессия целевых белков и их очистка. Экспрессия проводится в клетках e.coli и в клетках насекомых, в зависимости от целевого белка. Используемые методы экспрессии является традиционным для класса белков, и исполнители проекта внесли существенный вклад в их развитие. В ходе выполнения проекта предполагается оптимизация и доработка методов для целей проекта.

Третьей задачей проекта являются проверка функциональности белков - проверка качества полученных белковых препаратов. 

Четвертая задача проекта - получение кристаллов целевых белков. Используемые в данной работе белки (для части мишеней) поддаются кристаллизации в липидной кубической фазе.

Дальнейшие задачи проекта связаны непосредственно с проведением экспериментов в Европейском центре синхротронных излучения. Основным направлением деятельности является развитие метода серийной кристаллографии для сбора данных с набора мелких кристаллов и получения переходных состояний белка при комнатной температуре.

Результаты исследования

На данный момент достигнуты следующие результаты:

1)    Наработаны генетические конструкции белковых препаратов целевых фотоактивных белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) для проведения экспрессии в e.coli
2)    Выполнена экспрессия целевых фотоактивных белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum) в e.coli
3)    Выполнена функциональная характеризация фотоактивных белков (KR2 из Krokinobacter eikastus и bR из Halobacterium salinarum)
4)    Получены кристаллы фотоактивных белков 

 

Практическая значимость исследования
Областью применения данного исследования является структурная биология. Разрабатываемые подходу служат получению структур белков с набора кристаллов и их переходных состояний при комнатной температуре, с фокусом на мембранные белки - класс белков, который в настоящее время представляет особый интерес для структурных исследований.
В силу особого выбора белков-мишеней (фотоактивные мембранные белки KR2 и bR) проект представляет интерес для оптогенетики - метода контроля функционирования клеток и органелл при помощи света. Получаемая в проекте структурная информация позволит глубже понять принципы работы данных белков и возможно послужит созданию более тонких инструментов для фотоконтроля клетки. Другие белки-мишени проекта (Аденозиновый рецептор A2A и лейкотриеновый рецептор CysLT1) являются важными фармакологическими мишенями, связанными с регуляцией кровотока в миокарде, бронхоспазмом, повышением сосудистой проницаемости и проч. Структурные исследования данных белков создают задел для разработки соответствующих фарм-препаратов.
Развитие метода серийной кристаллография белков является чрезвычайно важной задачей для синхротронных источников рентгеновского излучения. В частности, в программе обновления Европейского центра синхротронных исследований на 2015-2020 года (ESRF UPGRADE PROGRAMME PHASE II (2015-2020), The Orange Book, стр. 28 - 30) серийная кристаллография и связанные с ней подходы объявляются методиками, которые будут доступны для пользователей после обновления мегаустановки. Помимо синхротронных источников излучения разрабатываемые подходы могут быть использованы на белковых станциях рентгеновских лазеров на свободных электронах, включая будущий eXFEL в Гамбурге, Германия (http://www.xfel.eu/).
Постер

Poster_template_IN.ppt