Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0064

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0064
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова"
Название доклада
Разработка технологии производства синтетической вакцины против гепатита Е
Докладчик
Исаева Ольга Владиславовна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на предотвращение потерь, связанных с заболеванием гепатитом Е (ГЕ), путем разработки технологии производства вакцины против этой инфекции.
Цель проекта – создание синтетической вакцины, эффективной против вируса гепатита Е (ВГЕ) человека и синтетической вакцины, эффективной против ВГЕ животных, циркулирующих на территории Российской Федерации.
Задачи проекта:
1. Создание и отработка диагностикума для выявления РНК ВГЕ методом ПЦР. Выбор геномных последовательностей вируса гепатита Е, отражающих генетическое разнообразие вариантов вируса, циркулирующих на территории РФ; 2. Создание синтетического пептида, аналогичного естественному антигену вируса ГЕ. Создание двух вариантов вакцинного препарата – для людей и для сельскохозяйственных животных за счет различных композиций адъювантов; 3. Оптимизация режимов крупномасштабного синтеза и очистки вакцинного препарата в двух вариантах – для людей и для ветеринарии; 4. Оптимизация условий повышения иммуногенности вакцинных препаратов: оценка эффективности использования известных адъювантов различной природы, а также разработка нанотехнологий с использованием препаратов на основе наноуглеродистых соединений; 5. Отработка моделирования in vivo инфекции вируса гепатита Е на мелких приматах (игрунковых обезьянах) и на сельскохозяйственных животных, восприимчивых к данной инфекции (кроликах, свиньях). Изготовление и доклинические исследования экспериментальных серий вакцины с помощью отработанной модели инфекции in vivo.
Актуальность и новизна исследования
Гепатит Е (ГЕ) является вирусной инфекцией, широко распространенной в странах тропического пояса, где по сути занимает экологическую нишу гепатита А, вызывая вспышки и спорадические случаи заболевания преимущественно среди молодых взрослых. Накопление сведений о циркуляции вируса гепатита Е (ВГЕ) и случаях ассоциированного с ним заболевания на территориях, ранее считавшихся неэндемичными (страны умеренного климата, в том числе Россия), сделало актуальным надзор за данной инфекцией и разработку способов ее специфической профилактики. До настоящего времени не получено эффективной клеточной системы, поддерживающей репликацию ВГЕ на высоком уровне и обеспечивающей значительную продукцию вируса. Поэтому единственным адекватным подходом к получению вакцины против ГЕ является экспрессия в клеточной культуре рекомбинантного капсидного белка ВГЕ, содержащего основные иммуногенные эпитопы. В настоящее время коммерчески доступная вакцина против ГЕ лицензирована только в Китае. Нами разработана вакцина против ГЕ, основанная на синтетической консенсусной последовательности штаммов ВГЕ, циркулирующих на территории России. В то же время, благодаря существованию только одного серотипа ВГЕ, данная вакцина эффективна против всех генотипов вируса, циркулирующих в мире.
Описание исследования

Был сконструирован синтетический ген, кодирующий капсидный белок ВГЕ генотипа 3, так как именно генотип 3 вируса широко распространен в странах умеренного климата, в том числе в России. Последовательность ВГЕ, выбранная для создания гена, является консенсусной для штаммов ВГЕ, выделенных на территории России. Первые 109 кодонов последовательности гена ORF2 ВГЕ были заменены олигогистидиновой меткой для  очистки экспрессированного белка. Для оставшейся последовательности, кодирующей аминокислотные остатки 110–660 капсидного белка ВГЕ, была проведена оптимизация кодонов для повышения эффективности экспрессии в клетках E.coli. Синтетический ген величиной 1719 п.о., кодирующий белок массой 60kDa, был встроен в экспрессионный вектор. Был отобран и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов штамм-продуцент PORF2.  Продуцируемый белок ORF2 ВГЕ очищали методом Ni2+-хелатной аффинной хроматографии. Экспрессию и очитку белка контролировали с помощью SDS-PAGE электрофореза и вестерн-блоттинга с коммерческими поликлональными антителами к ORF2 ВГЕ. 

Для оценки иммуногенности на мышах тестировали две фракции очищенного белка – вирусоподобные частицы (ВПЧ) и смесь всех изоформ белка . Мышей иммунизировали однократно дозами 2, 5 и 10 мкг белка с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Для оценки потенциального повышения иммуногенности использовали иммуномодулятор глутоксим в сочетании с гидроксида алюминием при введении тех же доз белка PORF2. Определение антител (анти-ВГЕ) проводили методом ИФА через 14 и 28 дней после иммунизации.

Для оценки на приматах иммуногенности вакцины, содержащей белок ВПЧ-PORF2 с глутоксимом и гидроксидом алюминия в качестве адъюванта, четырех обыкновенных мармозет (Callithrix jacchus) трижды иммунизировали (дни 0-21-42) внутримышечно 20 мкг VLP-PORF2. Два контрольных животных в те же сроки получали только адъювант (плацебо). Для оценки клеточного иммунного ответа была разработана панель меченых флуоресцентной меткой антител к Т-клеточным поверхностным антигенам мармозет (CD3, CD4 и CD8). Анти-ВГЕ у животных определяли в ИФА.

Безопасность (острую и хроническую токсичность, пирогенность) и реактогенность вакцины против ГЕ оценивали по стандартным методикам в ходе доклинических испытаний, в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (под ред. Миронова А.Н.).

В соответствии с задачами исследования разработаны процессы масштабирования производства экспериментальных образцов двух вакцин: «Вакцина против гепатита Е человека» (содержание антигена 20 мкг/доза, содержание алюминия гидроксида 0,5 мг/мл, содержание глутоксима 10 мг/мл) и «Вакцина против гепатита Е животных» (содержание антигена 20 мкг/доза, содержание алюминия гидроксида 0,5 мг/мл).  

Наработаны экспериментальные образцы двух вариантов вакцины против гепатита Е (для человека, серия №001Н -  количество  - 200 флаконов по 0,5 мл и сельскохозяйственных животных, серия №001А  - количество 200 флаконов по 0,5 мл).

Результаты исследования

Анализ геномных последовательностей российских штаммов ВГЕ, впервые в РФ произведенный в процессе создания базы данных изолятов вируса, подтвердил существование аминокислотных замен, характерных для российских изолятов. В результате разработки процесса масштабирования получения вакцины против ГЕ были получены первые экспериментальные серии вакцины против ГЕ человека и животных для проведения доклинических исследований вакцины.  Основные технологические различия получения двух вариантов вакцины – для получения препарата «Вакцина против гепатита Е человека» используются два этапа очистки антигена (АГ), в результате чего в состав препарата входит только фракция вирусоподобных частиц (ВПЧ). Для получения препарата «Вакцина против гепатита Е животных» используются один этапа очистки АГ, в результате чего в состав препарата входит только смесь всех изоморф белка ВГЕ, экспрессируемого штаммом-продуцентом – мономеры и димеры капсидного белка ВГЕ, а также ВПЧ. Препараты «Вакцина против гепатита Е человека» и «Вакцина против гепатита Е человека» различаются также составом адъювантов: для первого используется адъювант на основе алюминия гидроксида (0,5 мг/мл) с глутоксимом (10 мг/мл); для второго – только алюминия гидроксид (0,5 мг/мл). В отличие от аналогичных работ, выполненных в мире, продуцируемый АГ экспрессируется преимущественно в растворимой форме, что обеспечивает больший выход продукта при использовании более простых и щадящих методов очистки АГ. Таким образом, разработанные регламенты получения вакцины против ГЕ человека и животных позволяют впервые в мире получать большое количество капсидного белка ВГЕ в растворимой форме, способного собираться в ВПЧ, без использования этапа восстановления структуры очищенного белка. Исследования по оптимизации условий иммуногенности с использованием различных композиций адъювантов впервые продемонстрировали, что применение в композиции вакцины иммуномодулятора глутоксима обеспечивает наибольшую иммуногенность вакцины против ГЕ. При содержании антигена ВГЕ в препарате вакцины, равном 20 мкг, концентрация глутоксима 10 мг/мл давала увеличение иммуногенности у мышей по  сравнению со стандартной композицией вакцины с той же дозой АГ ВГЕ на 51,4%. В результате проведенных доклинических исследований впервые показано, что вакцина против гепатита Е вызывает клеточный и гуморальный иммунный ответ у всех иммунизированных обезьян. Продемонстрирована высокая иммуногенность вакцины на мышах. Исследования безопасности вакцины показали отсутствие значимых патологических изменений при изучении острой и хронической токсичности (не наблюдалось гибели животных, снижения двигательной и пищевой активности, изменения физиологических функций, не происходило снижения массы тела и внутренних органов, отсутствовали изменения гематологических и биохимических показателей периферической крови, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата на системы и органы лабораторных животных). Патологоанатомические исследования показали, что многократное введение препаратов вакцины против ГЕ не вызывало развития патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических процессов во внутренних органах животных. Изучение реактогенности также продемонстрировало апирогенность экспериментальной серии вакцины и отсутствие аллергизирующего действия в реакциях гиперчувствительности немедленного и замедленного действия. 

Практическая значимость исследования
Применение разработанной вакцины против гепатита Е в профилактической медицине позволит предотвратить заражение гепатитом Е и послужит средством специфической профилактики данной инфекции. Применение вакцины в ветеринарии для защиты поголовья домашних свиней от инфицирования ВГЕ будет способствовать ликвидации этого потенциального источника заражения ВГЕ для человека. Технология получения и экспрессии синтетического гена, разработанная и апробированная в данном проекте для производства вакцины против гепатита Е, может быть использована для получения других противовирусных вакцин. В настоящее время существует единственная вакцина против гепатита Е, лицензированная только на территории Китая и недоступная для применения в РФ, странах Европы и Северной Америки. Разработанная отечественная вакцина против ГЕ потенциально востребована на международных рынках, как готовый продукт и как технология получения вакцинного препарата.