Регистрация / Вход
Прислать материал

14.576.21.0019

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.576.21.0019
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Общество с ограниченной ответственностью "НОВЫЕ НАУЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ"
Название доклада
Разработка технологии создания новых лекарственных средств для лечения туберкулеза, вызываемого микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью, на основании новых низко-молекулярных ингибиторов серин-треониновой протеинкиназы класса аминотиазолов. Создание библиотеки низкомолекулярных химических соединений этого класса и проведение медико-биологических исследований по их отбору и оптимизации до лидерного соединения для последующих доклинических исследований.
Докладчик
Василевич Наталья Ивановна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Получение серии нетоксичных химических соединений, обладающих приемлемыми физико-химическими характеристиками и
следующими биохимическими свойствами:
1) они должны ингибировать серин-треониновые протеин-киназы M.tuberculosis.
2) они должны проявлять бактерицидную или бактериостатическую активность, направленную против микобактерий
туберкулеза, обладающих множественной или широкой лекарственной устойчивостью.
Актуальность и новизна исследования
Очевидно, что для такого распространенного заболевания, как туберкулез, разработка средств медикаментозной терапии (химиотерапии туберкулеза) является первостепенной задачей для медицины и фармакологической промышленности. Особенно это касается России, так как с начала 90х годов прошлого века частота этой болезни у нас возросла в 4 с лишним раза в связи с распадом системы советского здравоохранения. Положение обостряется в связи с тем, что появление и распространение новых лекарственных препаратов через некоторое время регулярно сопровождается последовательным возникновением устойчивых к ним форм микобактерий; новая устойчивость часто “наслаивается” на предыдущую, в результате приобретая множественный характер. Достаточно часто осуществляется заражение de novo штаммами, которые уже приобрели множественную лекарственную устойчивость. Новизна соединения заключается не только в патентной чистоте его химической структуры, но и в новом, ранее не задействованном в противотуберкулезных препаратах механизме действия – ингибировании серин-треониновых протеинкиназ. Новый препарат в силу этой особенности позволит обойти существующие механизмы лекарственной устойчивости, что откроет ему широчайшее применение для лечения MDR и XDR форм туберкулеза.
Предполагаемое соединение, таким образом, представляет собой значимый научный результат, позволяющий перейти к этапу создания собственно лекарства. Индустриальный партнер получит возможность провести доклинические и затем клинические исследования нового препарата, которые призваны завершиться как раз созданием противотуберкулезного препарата нового поколения.

Описание исследования

В ходе работ предыдущего этапа были получены новые соединения с улучшенными характеристиками. На данном этапе в ходе работ по оптимизации библиотеки была определена активность этих соединений таким же образом, как это было сделано на предыдущем этапе. Скрининг соединений на способность ингибировать бактериальные протеинкиназы на бактериальной тест-системе mycobacterium smegmatis aphviii+, также как тестирование отобранных соединений на способность ингибировать PKNA in vitro описан в отчете за предыдущий этап. 

Изучение туберкулостатической активности субстанции соединений проводились методом вертикальной диффузии с использованием лабораторного штамма H37Rv на плотной питательной среде «Новая».

Питательную среду разливали в пробирки по 5 мл, свертывая в наклонном положении таким образом, чтобы 1/2 часть дна пробирки оставалась свободной. Свернутую среду засевали по 0,1 мл взвеси Mycobacterium tuberculosis штаммом H37Rv, в разведении 1х108 КОЕ на мл, и в наклонном положении помещали в термостат. Через сутки пробирки ставили в вертикальное положение и по свободному краю закапывали по 0,3 мл субстанции соединений в исследуемых концентрациях: 12,5; 6,25; 3,1; 1,5; 0,75; 0,3 мкг/мл. Контрольные и опытные пробирки исследовали в трех независимых повторах. Затем пробирки в вертикальном положении помещали в термостат и при температуре 370 С инкубировали в течение 10 суток. Оценку роста M. tuberculosis проводили по стандартной методике, где появление зон задержки роста M. tuberculosis (более 10 мм) свидетельствовало о наличии туберкулостатических свойств в исследуемой концентрации соединений. В качестве контрольного препарата использовали изониазид.

Определение бактериостатической активности соединений в жидкой среде произведено в системе BACTEC MGIT 960.

Определение бактериостатической активности USN-14 в автоматизированной системе Bactec MGIT960

Антимикобактериальное действие тестируемых соединений изучают по динамике роста штамма M. tuberculosis H37Rv в обогащенной жидкой среде Middlebrook 7H9 в присутствии различных концентраций соединений по сравнению с ростом штамма на среде, не содержащей препаратов, и среде, содержащей контрольный препарат изониазид в критической концентрации 0,1 мкг/мл. При тестировании соединения методом пропорций сравнивают рост M. tuberculosis, культивируемых с тестируемым препаратом, с контрольной культурой, разведенной в 100 раз по сравнению с засеваемой в опытные пробирки. Культура считается чувствительной (а препарат действующим) к такой концентрации препарата, когда при достижении в контрольной пробирке показателей роста в 400 ОЕФ, в опытной пробирке показатели роста меньше 100 ОЕФ.

Определение ингибирующего действия лидерных соединений в отношении протеинкиназ микобактерий проводили по уменьшению степени фосфорилирования субстратов протеинкиназ в присутствии лидерных соединений.

Анализ возможного синергического эффекта исследуемых соединений с рядом противотуберкулезных препаратов (канамицин, рифампицин, стрептомицин, изониазид, моксифлоксацин и бедаквелин) проводился на модельном объекте, M. smegmatis mc2155, методом бумажных дисков: на диски наносили исследуемое соединение, противотуберкулезный препарат, либо их комбинацию и измеряли зону ингибирования роста после 40 часов инкубации при 37оС. 

 

 

 

Результаты исследования

1) Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы и проведены
патентные исследования, разработаны методики химического синтеза соединений-ингибиторов микобактериальных
протеинкиназ, разработаны методы определения биологической активности химических соединений как ингибиторов СТПК с
учетом их предполагаемых физико-химических характеристик, валидированы методики определения биологической
активности химических соединений как ингибиторов СТПК, оптимизированы и валидированы методики исследования
цитотоксичности in vitro, а также проведена закупка материалов для синтеза нетоксичных химических соединений, активность
и прочие свойства которых будут исследоваться на следующих этапах.
2) Делается вывод о принципиальной возможности создания ингибиторов СТПК, которые при этом являются
противотуберкулезными соединениями. Отмечается, что на настоящий момент в уровне техники не известно соединений,
проявляющих противотуберкулезную активность по механизму ингибирования СТПК. Разработана методика получения
аминотиазолов – потенциальных ингибиторов микобактериальных протеинкиназ. Структуры предполагаемых соединений
являются новыми, неизвестными в уровне техники
3) Проведен синтез библиотеки соединений, представляющей собой предварительную серию химических соединений с
предполагаемой противотуберкулезной активностью. Всего получено 176 соединений. Синтез проводили в соответствии с
методиками химического синтеза соединений-ингибиторов AP-VIII, разработанными на предыдущем этапе и вошедшими в
отчет о ПНИ за 1-й этап.
4) У полученных соединений определена растворимость и клеточная проницаемость (на основании модели проницаемости
через мембрану). Практически все полученные соединения обладают растворимостью в воде, достаточной для следующего
этапа исследований – определения их биологической активности. С другой стороны, высокая клеточная проницаемость
позволяет ожидать значительного проникновения соединений в клетку, что необходимо для подавления активности
микобактерий туберкулеза.
5) Определена биологическая активность и токсичность полученных соединений. Отобрано восемь соединений, активность и
токсичность которых делает их перспективными для дальнейшей разработки на следующем этапе. Растворимость и клеточная
проницаемость соединений были изучены на предыдущем этапе.
6) Проведен анализ структура-активность и синтезированы оптимизированные соединения. У этих соединений определена
активность, физико-химические свойства и токсичность.
7) По итогам анализа отобраны 3 соединения для исследования противотуберкулезной активности по отношению к обычным и
лекарственно-устойчивым формам туберкулеза.
 

В результате работ конкретно данного этапа:

 

Определена биологическая активность и токсичность соединений, полученных на предыдущих этапах. Отобрано 3 соединения, активность и токсичность которых делает их перспективными для дальнейшей разработки – определения противотуберкулезной активности по отношению к обычным и лекарственно устойчивым формам туберкулеза. Несмотря на то, что обнаружена низкая противотуберкулезная активность и не обнаружена бактериостатическая активность, обнаружен также выраженный синергический эффект соединений BAS 32449783 , BAS 51664197 с рифампицином, а также соединений BAS 98776113 и BAS 51664197 c бедаквилином.

Практическая значимость исследования
1) Области применения: медицина, фармацевтическая промышленность.
2) Перспективы использования: получение уникального продукта, позволяющего как заменить значительную часть импорта
соответствующих лекарственных препаратов, так и обладающего экспортным потенциалом.
3) Получаемый уникальный продукт (после проведения следующих за завершением проекта доклинических и клинических
исследований) позволит как заменить значительную часть импорта соответствующих лекарственных препаратов, так и
обладающего экспортным потенциалом. Это может изменить структуру производства лекарственных средств,
переориентировав его на собственное производство (внутри России), а также стимулирует дальнейшие научные исследования
микобактериальных серин-треониновых протеин киназ. Это позволит лучше понять функционирование микобактерий
туберкулеза и разработать еще новые технологии борьбы с ними.