Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0063

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0063
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Создание макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1
Докладчик
Малюченко Наталия Валериевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1.1. Разработка новых методических подходов для исследований транскрипционного фактора PARP1, являющегося мишенью действия противоопухолевых препаратов.
1.2. Предоставление научно-исследовательским организациям новых и эффективных методов и средств проведения исследований в области изучения механизмов транскрипции и, в частности, транскрипционных факторов, задействованных в механизмах канцерогенеза.
1.3. Получение значимых научных результатов по механизму действия PARP1 при транскрипции хроматина, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции (функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов, ингибирующих активность PARP1).
1.4. Создание обобщенной модели действия PARP1 методами компьютерного моделирования на основе полученных экспериментальных данных и на основе систематизации научно-технической литературы.
1.5. Получение макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1
Актуальность и новизна исследования
Фермент человека поли-АДФ-рибозо-полимераза 1 (PARP1) может служить перспективной молекулярной мишенью для поиска новых противоопухолевых препаратов, поскольку повышенная экспрессия PARP1 наблюдается при многих видах опухолевых заболеваний, в частности: при меланомах, раке легких и молочной железы и пр. Практически все существующие ингибиторы PARP1 ориентированы на связывание с НАД+-связывающей области PARP1 и конкуренцию с НАД+. При проведении расширенных клинических испытаний ингибиторов PARP1 обнаружена высокая токсичность, поскольку происходит интерференция со множеством ферментативных путей с участием НАД+. Все это в целом, обуславливает актуальность разработки новых подходов и тест-систем для поиска нетоксичных ингибиторов PARP1. Конечный продукт выполняемого проекта - функциональная система скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа действия PARP1. Каталитический центр молекулы PARP1 устроен сложным образом: в нем есть несколько карманов, поэтому есть возможность разработки соединений, проникающих не только в никотимамид-связывающий карман, но и другие примыкающие области, что будет создавать основу для разработки селективных к PARP1 соединений и уменьшать риск интерференции с другими НАД+ зависимыми ферментами. Кроме того, есть возможность искать мишени действия в других доменах PARP1, поскольку данный белок мультидоменный и, соответственно, активность PARP1 можно регулировать ингибированием других функциональных доменов, помимо каталитического домена. В проекте используется система анализа ингибирующей активности PARP1 в регуляции транскрипции и в регуляции связывния PARP-1 c хроматиновыми мишенями.
Описание исследования

В качестве основы для поиска новых ингибиторов PARP1 можно использовать нуклеосомы. Известно, что нуклеосомы являются структурообразующими единицами хроматина, которые позволяют компактизовать ДНК путем наматывания на нуклеосомный кор. Структура нуклеосом известна - они состоят из октамера гистонов, который опоясан 147 п.н. ДНК. С использованием нуклеосом проводят многочисленные исследования особенностей процессов транскрипции, репарации, репликации, поскольку нуклеосомы позволяют воссоздать упаковку ДНК, приближенную к естественной. Применение нуклеосомной системы анализа имеет ряд преимуществ, поскольку: 1) в ней воспроизводятся многие эффекты процесса ДНК-зависимых процессов, наблюдаемые в клетке; 2) система собирается из высокоочищенных компонентов: белков и нуклеиновых кислот, что в значительной степени облегчает интерпретацию данных, 3) возможно проведение модификаций  данной системы для проведения биохимического, молекулярно-генетического и флуоресцентного анализа; 4) также система может быть модифицирована (функционализирована) введением различных молекулярных мишеней действия лекарств, например, введением молекул, взаимодействующих в нуклеосомой ДНК или гистонами, в частности – PARP1. 
В рамках выполнения проекта исследуемые тест-системы скрининга  противоопухолевых препаратов – ингибиторов PARP1 собирали следующем образом: вначале проводили сборку мононуклеосом на нуклеосом-позиционирующих ДНК-матрицах (для флуоресцентных методов детекции матрицы метили FRET парой флуорофоров Cy3/Сy5 в проксимальном положении относительно входа ДНК в нуклеосому, для биохимических тестов использовали немеченые матрицы), затем вносили в полученный комплекс молекулярной мишени – белка PARP1 и его субстрата -НАД+ с последующим внесением тестируемых или контрольных химических соединений. В биохимических системах скрининга на собранных мононуклеосомах проводили транскрипцию, посредством лигирования матрицы с  линкером, несущим промотер, во флуоресцентных системах анализа транскрипцию не проводили, а исследовали изменения степени связывания PARP1с нуклеосомой при внесении в систему ингибитора PARP1

 

Результаты исследования

В 2016 году были получены экспериментальные образцы и в них  проведены тестовые испытания  ингибиторов PARP1, которые продемонстрировали, что наиболее стабильные и достоверные  результаты по действию ингибиторов PARP1 дают системы биохимического анализа, а именно система транскрипции in vitro на L603 нуклеосомных матрицах, при этом флуоресцентные системы анализа действия ингибиторов PARP1, несмотря на быстроту, информативность, нуждаются в дальнейшей доработке. Для доведения до стадии макета на основе флуоресцентного анализа требуется дальнейшая работа по стабилизации сигнала и нормализации системы. Поэтому в качестве макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1 выбрана не флуоресцентная, а молекулярно-биологическая/биохимическая система анализа действия ингибиторов PARP1.  Был изготовлен  макет функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1 и проведены его  испытания, а также была проведена оценка аналитической достоверности и диагностической информативности полученной системы.  По итогам испытаний было подготовлено заключение

Практическая значимость исследования
Выполнение проекта создаст необходимый научный и технологический задел для получения системы поиска и функциональной проверки новых противоопухолевых лекарственных препаратов, направленных на PARP1. Создаваемая в проекте система является миниатюрной функциональной системой, основанной на использовании нуклеосом. Нуклеосомная система функционализирована посредством введения PARP1 (молекулярной мишени действия противоопухолевых соединений). . Использование данной системы позволит сократить стадию «отсева» нефункционально активных молекул, которую традиционно проводят на клеточных культурах. Что в значительной степени удешевляет и убыстряет процесс поиска новых лекарственных соединений. Кроме того, разработка такой системы может быть перспективна для получения лекарств для терапии сердечно-сосудистых, воспалительных, нейродегенеративных заболеваний, а также влияющих на процесс старения клетки. В целом, проводимые исследования необходимы для дальнейшего развития фармацевтической и биотехнологической промышленности в России, а также для разработки новых методов и подходов в терапии социально значимых заболеваний.
Постер

Poster_Studitsky.ppt