Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0057

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0057
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Название доклада
Разработка кандидатного лекарственного средства на основе противоопухолевого белка лактаптина и онколитического вируса осповакцины
Докладчик
Рихтер Владимир Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования:
Разработать кандидатное лекарственное средство с направленной иммуностимулирующей и апоптоз-индуцирующей противоопухолевой активностью на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина.

Задачи исследования:
1. Получить рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и ГМ-КСФ человека.
2. Оценить онколитическую активность рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, продуцирующего ГМ-КСФ и лактаптин, на культурах раковых клеток человека in vitro и на опухолевой модели рака молочной железы in vivo.
3. Оценить острую токсичность полученных рекомбинантных штаммов вируса осповакцины.
Актуальность и новизна исследования
Онколитические вирусы все чаще звучат в исследованиях и медицинской практике как перспективные средства для лечения опухолей (Lawler, 2016). В последние годы наблюдается интенсификация работ по созданию и клиническому тестированию лекарственных препаратов на основе онколитических вирусов. Только в 2016 году в США было проведено около 40 клинических испытаний целого ряда онколитических вирусов в отношении злокачественных опухолей разного генеза (Lawler, 2016).
Онколитические вирусы могут быть генетически модифицированы для оптимизации опухолевой селективности и усиления иммунной стимуляции (Kaufman, 2015; Swift, 2016). Высокий противоопухолевый потенциал продемонстрировали рекомбинантные штаммы герпесвируса, вируса осповакцины и аденовируса, а также природные штаммы вируса кори, коксаки, реовируса, парво- и полиовирусов (Choi, 2016). Большим прорывом явилось одобрение FDA в США в октябре 2015 года препарата IMLYGIC™ на основе генетически модифицированного вируса герпеса для лечения рецидивирующей меланомы. IMLYGIC™ представляет собой аттенуированный вирус простого герпеса 1 типа с делециями генов-факторов нейровирулентности ICP34.5 и ICP47, экспрессирующий ГМ-КСФ человека (Dolgin, 2015).
Таким образом, наша работа по созданию рекомбинантного онколитического вируса осповакцины для лечения опухолей молочной железы и ряда других видов рака является актуальной и находится в русле самых современных тенденций онкотерапии. Новизна работы заключается в использовании комбинации трансгенов – ГМКСФ и лактаптина, природного онкотоксического белка с апоптоз-индуцирующей активностью.
Описание исследования

В данном проекте создано кандидатное противоопухолевое лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и ГМ-КСФ человека. Ген ГМ-КСФ встроен в район частичной делеции гена вирусной тимидинкиназы, а ген лактаптина - в район частичной делеции гена вирусного ростового фактора. Проведено сравнение противоопухолевой эффективности несекретируемой и секретируемой форм лактаптина в составе рекомбинантного вируса. Все рекомбинантные варианты вируса получены на основе штамма Л-ИВП VACV, который широко применялся для вакцинации людей против оспы в России.

Для получения делеционных по гену вирусного ростового фактора вариантов вируса осповакцины и для встройки вместо делетированного участка трансгена лактаптина сконструированы инсерционные векторные плазмиды. Ген лактаптина введен под контроль высоко эффективного синтетического ранне-позднего промотора VACV. Для получения секретируемого варианта белка в N-конец последовательности введен сигнальный пептид ГМ-КСФ.

Рекомбинанты получены методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к пуромицину.             Подтверждение структуры генома рекомбинантных вариантов VACV проводили методом ПЦР с праймерами на район встройки. Подтверждение экспрессии гена лактаптина в составе рекомбинантного вируса осуществляли методом Вестерн-блот анализа.

Препаративную наработку рекомбинантных штаммов проводили на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России. Очистку вирусов осуществляли центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (25-45%). Инфекционность вирусов оценивали по количеству бляшкообразующих единиц, образованных вирусом на монослое клеток CV-1. Аттенуацию рекомбинантных вирусов измеряли по величине ЛД50 исходного и рекомбинантного штамма для 10-дневных куриных эмбрионов. Онколитическую активность рекомбинантных вирусов на культурах раковых клеток человека оценивали путем определения 50%-ной цитотоксической дозы (ИК50) с использованием реагентов МТТ (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид) и /или ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид). Оценку противоопухолевой активности рекомбинантных штаммов вируса проводили на опухолевых моделях алло и ксенотрансплантатов. Оценку острой токсичности и реактогенности проводили на белых беспородных мышах.

Результаты исследования

В качестве вектора для создания онколитических вирусов в проекте используется вирус осповакцины. Клинические испытания препаратов на основе вируса осповакцины широко идут в настоящее время в США, Канаде и Европе. Во всех случаях испытываются рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с делециями генов - факторов вирулентности и встройками трансгенов цитокинов, репортерных и ряда других белков (Choi, 2016). В настоящем проекте встройка в качестве одного из трансгенов гена лактаптина в район делеции гена вирусного ростового фактора способствует как дополнительной аттенуации (ослаблению) вируса в отношении нормальных клеток, так и усилению его литической (цитотоксической) активности в отношении раковых клеток. Таким образом, результаты, полученные при выполнении проекта, соответствуют мировому уровню исследований по созданию противоопухолевых лекарственных средств на основе онколитических вирусов.

При выполнении проекта получены следующие результаты:

- Разработана методика конструирования инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса. Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat.

- Разработана методика получения рекомбинантных штаммов вируса осповакцины. Получены рекомбинантные штаммы VV-GMCSF-Lact, VV-GMCSF-S(long)-Lact; VV-GMCSF-S(long)-Lact.

- Разработан Лабораторный регламент № ЛР 01538629 -01- 2015 «Кандидатное лекарственное средство на основе противоопухолевого белка лактаптина и онколитического вируса осповакцины».

- Структура и стабильность рекомбинантных штаммов подтверждена методом ПЦР и последующим секвенированием района встройки. Экспрессия гена лактаптина в составе рекомбинантных штаммов проанализирована методом иммуногистохимии в клетках почки китайского хомячка BHK. Цитотоксическая активность рекомбинантов в отношении клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF 7 и MDA-MB-231 подтверждена методом МТТ/ХТТ теста.

- Проведен подбор методов анализа специфической активности экспериментальных образцов: - оценка цитотоксической активности на культурах раковых клеток молочной железы человека (МТТ/ХТТ тест); - оценка противоопухолевой активности на экспериментальных животных с трансплантированными опухолями.

- Разработана Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных штаммов. Проведена оценка онколитической активности рекомбинантных вирусов на культурах раковых клеток человека различного генеза. Наиболее чувствительными к действию рекомбинантных штаммов оказались клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231 и BT-549. Показано, что полученные рекомбинантные штаммы не вызывают острой токсичности и реактогенности при подкожном введении белым беспородным мышам в дозе не ниже 1*107 БОЕ/мышь. Аттенуация (ослабление вирулентности) всех рекомбинантных штаммов вируса превышает аттенуацию исходного штамма Л-ИВП не менее чем в 10 раз. Проведена оценка онколитической и противоопухолевой активности рекомбинантных штаммов на лабораторных животных.

- Разработано ТЭО разработки продукции, проект ТЗ на ОТР и рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономике, дальнейших исследованиях и разработках.

Практическая значимость исследования
Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении:
- методика конструирования инсерционных плазмид, обеспечивающих встройку необходимых генов в геном осповакцины, и методика получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего две встройки генетического материала, могут быть использовании при создании рекомбинантных вариантов различных вирусов с заданными свойствами.
- полученные рекомбинантные штаммы вируса, обладающие одновременно иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами, могут являться основой для создания фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм.
Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.
Результаты проекта будут востребованы международным научным сообществом, в том числе при представлении на международных конференциях, и могут являться основой для международных фундаментальных исследований и прикладных проектов.
Презентация

Presentation_14.604.21.0057.ppt