Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0109

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0109
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Название доклада
Разработка прототипов иммунобиологических препаратов на основе модифицированного сигнальными последовательностями антигена вируса бешенства
Докладчик
Стародубова Елизавета Сергеевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработать безопасные, высокостабильные и низкобюджетные прототипы иммунобиологических ДНК-вакцинных препаратов на основе модифицированного методами генной инженерии антигена вируса бешенства. Иммунобиологические препараты должны быть направлены на профилактику вируса бешенства.
1.1 Разработать подход по модификации вирусных антигенов, которые могут быть использованы для повышения эффективности иммунобиологических препаратов для профилактики или терапии различных вирусных заболеваний человека.
1.2 Создать прототип иммунобиологического препарата на основе вирусного антигена с генно-инженерными модификациями, которые позволяют направленно регулировать силу и специфичность иммунного ответа.
Актуальность и новизна исследования
Своевременная и доступная вакцинация от бешенства продолжает оставаться важным вопросом здравоохранения как в России, так и во всем мире. На сегодняшний день для предупреждения бешенства используют культуральные антирабические вакцины и на рынке отсутствуют рекомбинантные антирабические препараты. Сейчас разрабатываются различные рекомбинантные антирабические вакцины, которые должны иметь достаточно простые технологии производства, нетребовательность к условиям хранения и транспортировки и невысокую себестоимость.
В настоящем исследовании предложена разработка прототипов иммунобиологических ДНК-вакцинных препаратов на основе модифицированного методами генной инженерии антигена вируса бешенства. Препараты данного типа имеют простые и низкобюджетные технологии производства, могут быть легко модифицированы, способны вызывать защиту от инфекций, а также не требуют специализированных условий хранения.
Описание исследования

В качестве антигена вируса бешенства для создания прототипа иммунобиологического ДНК-вакцинного препарата был выбран белок G вируса (гликопротеин), для которого известно, что наличие антител к нему защищает от развития болезни. В базах данных был проведен поиск и анализ аминокислотных последовательностей белков G вирусов бешенства, зарегистрированных на территории РФ, и на их основе составлены консенсусная аминокислотная последовательность гликопротеина вируса бешенства и соответствующая ей нуклеотидная последовательность, оптимизированная по представленности кодонов. Генно-инженерными методами получен синтетический ген белка G вируса бешенства, а также вектор, в состав которого входит данный ген и который позволяет экспрессировать данный ген в эукариотических клетках. Затем проведены модификации данного гена и генно-инженерными методами получено еще три экспериментальных образца вариантов прототипа иммунобиологического препарата. В этих вариантах к белку G с консенсусной аминокислотной последовательностью добавлены различные пептиды, регулирующие направление антигена по протеосомному или лизосомному пути деградации и узнавание его антигенпредставляющими клетками. На культурах клеток человека и мыши проведена оценка уровня накопления модифицированного вирусного антигена в клетках и проверена его внутриклеточная локализация. Для этого использовали методы Вестерн-блот и иммунофлуоресцентную микроскопию клеток. Полученные экспериментальные образцы были подвергнуты испытаниям на условия хранения и анализ интактности препаратов проводили с помощью электрофореза в агарозном геле. Свойства модифицированных антигенов, кодируемых экспериментальными образцами, были оценены  in vitro. Проведены исследования по определению времени полужизни в клетке и деградации модифицированных антигенов протеасомами или лизосомами. Были использованы подходы по оценке содержания белка вестерн-блотом после остановки трансляции циклогексимидом или при обработке клеток специфическими ингибиторами протеасомы или лизосом. На лабораторных мышах, крысах и кроликах были проведены испытания препаратов на острую и хроническую токсичность. Исследования иммуногенности экспериментальных образцов вариантов прототипа иммунологического препарата in vivo проведены на лабораторных мышах. На малой группе животных были проведены исследования по определению способа и дозы введения лабораторным животным экспериментальных образцов вариантов прототипа иммунологического препарата. Проведен подбор условий проведения иммунологических тестов, а именно для определения наличия антител иммуноферментным анализом. Для проведения иммуноферментного анализа получен штамм бактерий, экспрессирующий гликопротеин вируса бешенства. Белок был наработан и очищен из клеток методом аффинной хроматографии. Подобранные условия были использованы для иммунизации большой группы мышей ( 15 животных) четырьмя различными вариантами разработанного нами прототипа иммунологического препарата. Получены сыворотки от мышей и проанализированы на наличие антител иммуноферментным методом.

Результаты исследования

Среди современных разработок перспективными являются препараты, созданные по стратегии усиления иммунного ответа на антиген за счет изменения процессинга при создании химерного белка. Один из таких способов стал предметом патентования и лицензирования (LAMP-vax™ DNA plasmids) и служит платформой доклинических испытаний противовирусных вакцин и клинических испытаний иммунотерапевтической вакцины (GRNVAC1, Geron Corporation).

В данной работе генно-инженерными методами получено 4 экспериментальных образца вариантов прототипа иммунобиологического препарата на основе гликопротеина вируса бешенства. Они представляют собой плазмиды для экспрессии генов в эукариотических клетках. Одна из них содержит оптимизированную по представленности кодонов нуклеотидную последовательность, кодирующую гликопротеин (белок G) вируса бешенства с консенсусной аминокислотной последовательностью, которая составлена на основе последовательностей гликопротеина изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории Российской Федерации. В трех других к белку G с консенсусной аминокислотной последовательностью добавлены различные сигнальные последовательности, регулирующие направление антигена по протеасомному (белок FAT10), или лизосомному (домен белка CD63) пути деградации и узнавание его антигенпрезентирующими клетками (лидерная последовательность белка NS1 и домен белкаCTLA-4).

На культурах клеток человека и мыши работоспособность полученных векторов, которые обеспечивают синтез и накопление заданных белков в клетках человека и мыши. Проверка внутриклеточной локализации синтезируемых белков в клетках человека продемонстрировала способность использованных сигнальных последовательностей изменять локализацию исследуемых белков.

Исследования по определению стабильности и условий хранения экспериментальных образцов вариантов прототипов иммунобиологических препаратов показали, что полученные экспериментальные образцы могут быть стабильны и в них отсутствует деградация при хранении в условиях 20°C ± 5°C.

Показано, что добавление сигнальных последовательностей к молекуле антигена изменяет время полужизни модифицированных антигенов в клетке. Установлено, что ингибирование протеасомной активности увеличивает накопление в клетке всех исследуемых вариантов. Однако содержание исходного и консенсусного гликопротеина, а также варианта с сигналами NS1 и CTLA1 увеличилось только в 1,5 раза. Значительный эффект (в 5 и 13 раз) наблюдался для вариантов гликопротеина с сигналом FAT10 и доменом CD63 соответственно. Показано, что использование ингибиторов лизосомных протеаз незначительно изменяет накопление в клетке вариантов модифицированного гликопротеина.

В ходе выполнения проекта осуществлен подбор и анализ первичных условий проведения иммунизации и иммунологических тестов. Подобраны условия проведения иммунологического теста по определению антител в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа. Получен бактериальный штамм, экспрессирующий консенсусный гликопротеин вируса бешенства, и получен препарат очищенного рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства. Было показано, что однократное введение ДНК-вакцинного препарата лабораторным мышам вызывает образование специфических антител. Проведены исследования по определению способа и дозы введения лабораторным животным экспериментальных образцов вариантов прототипа иммунобиологического препарата. Установлено, что при внутримышечном введении максимальный титр антител достигается при введении 100 мкг плазмиды. При подкожном введении наиболее эффективно введение 40 мкг плазмиды. При этом титр антител при внутримышечном введении выше, чем при подкожном введении. В выбранных оптимальных условиях была проведена иммунизация групп мышей экспериментальными образцами вариантов прототипа иммунобиологического препарата. Показано наличие антител к гликопротеину в группах мышей, получавших экспериментальные образцы прототипа иммунобиологического препарата на основе модифицированного антигена вируса бешенства.

Практическая значимость исследования
Полученные в ходе проведения ПНИ результаты могут быть использованы:
- для планирования и реализации дальнейших фундаментальных и прикладных исследований, направленных на создание коммерческих иммунобиологических препаратов для диагностики, профилактики и лечения различных вирусных заболеваний, в особенности бешенства;
- для практического применения в профилактике бешенства в специализированных медицинских учреждениях.
Разработанные в рамках ПНИ иммунобиологические препараты позволят расширить каталог продукции и технологических решений предприятий, повысят конкуренцию и удовлетворят часть спроса в области антирабических иммунобиологических препаратов.