Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0132

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0132
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Разработка биоинспирированных наноструктурных функционально-ориентированных материалов, адаптированных к технологии прототипирования, для замещения костно-хрящевых дефектов.
Докладчик
Сергеева Наталья Сергеевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель: создание биоинспирированных наноструктурных функциональноориентированных материалов, адаптированных к технологии прототипирования, для замещения костно-хрящевых дефектов
Задачи:
• разработать план биологических исследований по функционализации экспериментальных образцов трехмерного каркаса (ЭОТК) состава альгинат натрия/желатин/ОКФ (октакальцийфосфат);
• разработать способы насыщения ЭОТК указанного состава: а) антибиотиком, б) противоопухолевым препаратом, в) факторами роста;
• исследовать в биологических моделях динамику высвобождения: а) антибиотика, б) противоопухолевого препарата, в) факторов роста из ЭОТК состава альгинат натрия/желатин/ОКФ;
• изучить в модельных экспериментах in vitro и in vivo бактериостатическое / бактерицидное действие ЭОТК, насыщенного антибиотиком;
• исследовать в модельных экспериментах in vitro и in vivo специфическую активность ЭОТК, насыщенного противоопухолевым препаратом;
• исследовать в модельных экспериментах in vivo остеокондуктивные потенции ЭОТК, насыщенного факторами роста (ФР) из лизата тромбоцитов (ЛТ), в аспекте активизации остеогенеза;
• оценить биосовместимость и остеозамещающие потенции линейки наноструктурных функционально-ориентированных ЭОТК состава альгинат натрия/желатин/ОКФ в экспериментах in vivo;
• провести дополнительные патентные исследования и подготовить заявку на охранный документ;
• провести маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД, полученных при выполнении ПНИ.
• провести работы по материально-техническому обеспечению работ этапа.
Актуальность и новизна исследования
Разработка биоматериалов, предназначенных для восстановления костных дефектов, остается актуальной проблемой, что обусловлено распространенностью патологических состояний костной ткани и неудовлетворительными результатами их лечения. Реабилитация этих категорий больных возможна лишь при достижении структурной и функциональной целостности костной ткани, что требует адекватных остеопластических материалов, в том числе способных осуществлять адресную доставку в костные дефекты лекарственных средств. К сожалению, до сих пор не удавалось создать такие синтетические материалы, что обосновывает актуальность настоящего исследования.
В последние годы были разработаны методы 3D печати, которые могут быть применены для изготовления индивидуальных имплантатов заданной конфигурации. Основываясь на данных о композиционной структуре межклеточного вещества костной ткани, перспективным представляется использование для 3D-печати биосовместимых полисахаридов (альгината и желатина) и керамики на основе фосфатов кальция (ФК), в частности ОКФ – предшественника биологического апатита, способствующего процессу биоминерализации формирующейся костной ткани.
Новизна настоящего исследования заключается в том, что: разработан биосовместимый полимер с требуемыми для 3D печати свойствами; разработана технология симбатного прототипирования полимерного каркаса с in situ синтезом неорганической (кальцийфосфатной) фазы; разработана методология функционализации композиционных каркасов, полученных путем 3D печати, антибиотиком/противоопухолевым препаратом/ФР из ЛТ; установлена их биосовместимость, наличие остеопластических свойств и специфической активности.
Описание исследования

Изготовление экспериментальных образцов трехмерных конструкций (ЭОТК) осуществляли по разработанным, защищенным заявками на патент, технологиям.

На этапах отработки подходов к функционализации ЭОТК проводили исследование морфологии их поверхности, состава, прочностных характеристик, текучести и вязкости «чернил», с использованием сканирующей электронной микроскопии (электронный микроскоп Tescan VEGA II), ИК - спектроскопии (ИК-Фурье спектрометр Nicolet-380, ThermoScientific), механических испытаний (испытательная машина Instron ElectroPuls E3000, США).

Разработана биологическая модель для исследования динамики выхода терапевтических препаратов из ЭОТК, насыщенных тремя способами: инфильтрации водными растворами (ванкомицин, доксорубицин), инкорпорации на биомиметически модифицированную поверхность(ванкомицин, ФР из ЛТ) и добавления в состав гидрогеля для печати (ванкомицин, доксорубицин, ФР из ЛТ).

 Посредством аналитических методов: спектрофотометрия (ванкомицин), флуориметрия (доксорубицин), ИФА ФР (PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF-A, IGF-1 и TGF-beta1) из ЛТ, была исследована эффективность указанных способов насыщения конструктов лекарственными препаратами и динамика выхода этих препаратов из конструктов.

Исследования цитотоксичности конструктов выполнены на модели культур карциномы молочной железы человека MCF-7 и карциномы молочной железы мыши Ca-755 с помощью МТТ-теста.

Исследование антибактериальной активности ЭОТК, насыщенных антибиотиком ванкомицином, выполнено в соответствии со следующими нормативными документами: приказ Минздравсоцразвития России № 708н от 23 августа 2010г. «Об утверждении Правил лабораторной практики» (с изменениями и дополнениями); национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; межгосударственный стандарт ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий»; санитарно-эпидемиологические правила СП 1.2.2322 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (с изменениями и дополнениями); методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

При разработке схемы тестирования функционализированных ЭОТК in vivo все эксперименты на животных планировались согласно Руководству по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях (под редакцией Н.Н.Каркищенко и С.В.Грачева. М., 2009), а также Правилам Европейской Конвенции ET/S 129, 1986 и директиве 86/609 ESC работы с экспериментальными животными. Исследование бактериостатического / бактерицидного действия экспериментальных образцов трехмерного каркаса на основе полисахарид – фосфат кальция, насыщенного ванкомицином, осуществляли на модели эксцизионной инфицированной раны на коже крыс.

Исследование индивидуальной противоопухолевой активности ЭОТК, насыщенных доксорубицином, проводили на модели карциномы молочной железы мышей Са-755 в соответствии с "Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств" (глава "Методические рекомендации по изучению противоопухолевой активности лекарственных веществ"). 

Исследования биосовместимости функционализированных образцов прототипов трехмерного каркаса осуществляли на модели подкожной имплантации ЭОТК мышам BDF1 с последующей гистологической экспертизой на ранних сроках наблюдения.

Для in vivo исследования остеокондуктивных потенций функционализированных ЭОТК использована модель костного дефекта - краевая резекция большеберцовой кости крыс-самцов линии Wistar (сроки наблюдения до 1 года).

Все гистологические препараты исследовали методом световой микроскопии с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 40C (Германия) с цифровой фотокамерой и персональным компьютерным обеспечением для архивирования документированных данных.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программ Statistica 10.0 и MS Excel 2010. Значимость различий между группами оценивали, в зависимости от задач с помощью непараметрического критерия Краскелла – Уоллиса и критерия Манна - Уитни.

Результаты исследования

Разработаны три методики насыщения ЭОТК лекарственными и биологически активными веществами: а) путем инфильтрации готового каркаса водным раствором лекарственного средства, б) путем введения препарата в состав «чернил» для печати ЭОТК, в) путем создания на поверхности готового ЭОТК дополнительного слоя ФК, содержащего искомое лекарственное средство. Все исследования этапа выполнены на ЭОТК состава альгинат натрия/желатин/ОКФ (56/14/30 % масс.).

По первому способу насыщения подобраны условия инфильтрации ЭОТК раствором ванкомицина по всему объёму конструктов без изменения их прочностных характеристик. По второму способу разработана технология трехмерной печати ЭОТК многокомпонентными гидрогелевыми композицями, содержащими ванкомицин/доксорубицин/ФР из ЛТ доноров, без изменения физико-химических свойств каждой составляющей. При разработке биомиметического подхода найдены оптимальные условия формирования на ней слоя ФК и отработаны условия инкорпорирования ФР из ЛТ доноров и ванкомицина в модифицированную поверхность ЭОТК.

Установлено, что количества включенных в ЭОТК лекарственных и биологически активных средств и динамика их выхода зависят от способа насыщения и от свойств насыщающих агентов. Наиболее интенсивный выход агентов из конструктов наблюдался в модельной системе в первые часы инкубации и завершался к 1 -6 суткам.

Изучена специфическая активность функционализированных ЭОТК. На модели штамма Staphylococcus aureus in vitro выявлена выраженная антибактериальная активность ЭОТК, насыщенных ванкомицином всеми тремя способами. . In vivo (крысы) показано, что имплантированные ЭОТК с ванкомицином, эффективно препятствуют развитию воспалительного инфекционного процесса, индуцированного в коже введением Staphylococcus aureus.

На модели тест-культур клеток РМЖ человека MCF-7 и РМЖ мышей Са-755 in vitro показана специфическая (цитостатическая) активность ЭОТК, насыщенных доксорубицином путем включения его в состав чернил для 3D печати и инфильтрацией готовых трехмерных конструкций.

На модели подкожной имплантации мышам функционально-ориентированных ЭОТК установлено, что введение ванкомицина в состав чернил для печати не влияет на биосовместимость ЭОТК; введение ЛТ улучшает биосовместимость ЭОТК; доксорубицин оказывает цитотоксический эффект на окружающие ткани в месте имплантации ЭОТК, приводящий к формированию участков фиброза.

В экспериментах in vivo на модели дефекта большеберцовой кости продемонстрированы остеокондуктивные потенции функционализированных ЭОТК, насыщенных ФР из ЛТ путем биомиметического осаждения в слой ФК. Функционализация ЭОТК ванкомицином в процессе 3D печати сохраняет их остеопластические потенции; функционализация ФР из ЛТ приводит к активации процесса неоваскулогенеза в зоне имплантации; при функционализации доксорубицином отмечено формирование фиброзной капсулы вокруг трехмерного конструкта, препятствующей на ранних сроках качественной интеграции имплантата с материнским ложе и резорбции ЭОТК.

Проведен дополнительный патентный поиск по основным патентным базам. Установлены наиболее близкие по техническому решению патенты и выявлены их отличия от разрабатываемых технологий.

В рамках маркетингового исследования установлено, что ожидаемый продукт данного проекта (защищенный заявкой на изобретение) является принципиально новым. На рынке отсутствуют такие материалы и технологии, поэтому перспективы коммерциализации очевидны.

Практическая значимость исследования
Результаты данного проекта могут служить базой для ОКР, связанных с реализацией предложенных решений в сегменте «Технологии аддитивного производства индивидуальных функционально- ориентированных конструкций для регенеративной медицины». Под функциональной ориентированностью новых наноструктурных материалов подразумевается возможность их многопрофильного использования: не только в качестве «простого» имплантационного материала, а также как конструкции с биоинспирированной поверхностью, содержащей биологически активные молекулы или лекарственные средства, что будет обеспечивать их адресную доставку в пораженную область.
Применение таких материалов позволит: а) в онкологии - достигнуть качественного остеогенеза при замещении критических дефектов сложной геометрии и повысить эффективность противоопухолевой терапии за счет улучшения биодоступности костной ткани для противоопухолевых препаратов, снизить токсичность системного воздействия; б) в ортопедии и травматологии - достигнуть качественного остеогенеза при замещении критических дефектов сложной геометрии и снизить частоту инфекционных осложнений костной раны.
Исследования, разработка и производство современных имплантационных материалов составляют существенный сегмент современного рынка наукоемких технологий. Потребность в Европе в имплантатах для регенеративной медицины прогнозируется, к 2020 - $ 43 млрд., а к 2025 году — $ 52 млрд. [Форсайт-прогноз Европейской комиссии «Technology and market perspective for future Value Added Materials», http://europa.eu]. Согласно BCC research.com. ежегодная емкость рынка нанокомпозитов для медицины будет расти на 25 % в год.
Таким образом, данный проект является актуальным, имеет научно-практическую и социальную значимость в области здравоохранения, соответствует современному уровню нанотехнологий в медицинском материаловедении, а результаты разработки имеют очевидные перспективы для коммерциализации.