Регистрация / Вход
Прислать материал

14.584.21.0012

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.584.21.0012
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет "МИФИ"
Название доклада
Разработка новых нанозондов для молекулярной визуализации с помощью конъюгатов квантовых точек, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, и однодоменных антител
Докладчик
Набиев Игорь Руфаилович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели проекта:

1.​ Разработка диагностических нанозондов на основе ориентированных конъюгатов квантовых точек CuInS2/ZnS или Ag2S, флуоресцирующих в оптическом диапазоне 700-1700 нм, и однодоменных антител специфичных к опухолевому маркеру HER2.
2.​ Применение разработанных диагностических нанозондов для визуализации опухолевых маркеров в культуре клеток и в животных моделях in vivo с целью тонкой визуализации границы опухолевого роста, а также для высокоточной ранней дифференциальной диагностики злокачественных новообразований.

Задачи проекта:

1.​ Синтезировать квантовые точки, флуоресцирующие в инфракрасной области спектра (ИК-КТ), имеющих различный химический состав, и разработать методики их солюбилизации и стабилизации в водных растворах.
2.​ Получить биосовместимые ИК-КТ с различной полимерной модификацией поверхности и различными функциональными группами на поверхности.
3.​ Провести анализ цитотоксичности полученных препаратов ИК-КТ в модельных экспериментах in vitro и in vivo.
4.​ Получить модифицированные рекомбинантные однодоменные антитела (ОД-АТ), распознающие специфический опухолевый маркер HER2 и изготовить ориентированные конъюгаты ИК-КТ с ОД-АТ – диагностические нанозонды.
5.​ Исследовать и охарактеризовать полученные нанозонды для визуализации опухолевого маркера HER2 в культурах клеток in vitro.
6.​ Исследовать и охарактеризовать полученные нанозонды для визуализации опухолевого маркера HER2 на животных моделях in vivo.
Актуальность и новизна исследования
Злокачественные новообразования человека и высокий уровень смертности (1,7 млн смертей в год только в Западной Европе при существенно худшей статистике в Российской Федерации), связанный с быстрым опухолевым ростом и метастазированием. Специфически функционализированные флуоресцентные КТ, избирательно и с высокой степенью чувствительности распознающие молекулярные детерминанты различных типов опухолевых клеток, представляют значительный интерес для онкологической практики и, в частности, для эндоскопии и интраоперационной визуализации опухолей.
Уникальные оптические и физико-химические свойства коллоидных наночастиц, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, делают их идеальными объектами для прижизненной интраоперационной визуализации опухоли с высоким разрешенем, детекции биомаркеров в опухолевых тканях с чувствительностью, недостижимой ни одним из существующих методов. Яркость флуоресцентных КТ на порядки величины превышает яркость лучших органических флуорофоров, они фотостабильны и отличаются очень узкими полосами испускания флуоресценции разных цветов, в зависимости от своего размера при возбуждении одной и той же длиной волны. В дополнение к этому, использование КТ, флуоресцирующих в инфракрасной области спектра, позволяет избежать нежелательной автофлуоресценции биологических тканей. Возбуждение таких КТ характеризуется гораздо большей проникающей и индуцирующей способностью, чем облучение светом ультрафиолетовой и видимой области спектра, т.к. в области 700-1700 нм отсутствует поглощение и рассеяние света белками или молекулами воды. Благодаря этому появляется возможность визуализировать структуры живых тканей в функционирующем организме in vivo.
Описание исследования

В результате работ подготовлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе произведен обзор следующих научных информационных источников: статей в ведущих зарубежных и российских научных журналах. Проанализировано 90 источников, в том числе 44 источника за период 2010-2015 г.г. Были изучены преимущества и будущие перспективы применения нанозондов для молекулярной визуализации опухолевых маркеров в культуре клеток и в животных моделях in vivo с помощью конъюгатов КТ. Проведен сравнительный анализ результатов научных исследований, проводившихся по аналогичной тематике. Также были проведены патентные и информационные исследования по теме ПНИ. Иностранным партнером разработана методика синтеза в органической фазе квантовых точек люминесцирующих в ИК области (CuInS2 и AgS2). Разработана методик нанесения на поверхность КТ оболочки широкозонного полупроводника для повышения стабильности увеличения квантового выхода люминесценции. Синтезированы и переданы в ЛНБИ КТ люминесцирующие в ИК области: CuInS2/ZnS и Ag2S/AgInS2/ZnS. С использованием полученных преператов КТ были разработаны методики солюбилизации и стабилизации в водных растворах инфракрасных КТ с помощью гибридных соединений, содержащих 6 остатков этиленоксида, а также алифатические гидрофобные цепи, включающие 6 атомов углерода.

Получены рекомбинантные модифицированные однодоменные антитела (одАТ), распознающие опухолевый макер HER2, и разработана методика конъюгации одАт с ИК-КТ. На первом этапе была произведена сшивка линкерной молекулы нейтравидина с поверхностью ИК-КТ. Для этого модифицировали молекулы нейтравидина введением сульфгидрильной группы, а на следующей стадии проводили кросс-сшивку нейтравидина и ИК-КТ. Последним этапом приготовления нанозонда являлась сборка конъюгата одАТ с ИК-КТ за счет специфического и ориентированного связывания биотина на С-конце молекулы одАТ и нейтравидина на поверхности ИК-КТ. Были протестированы специфическая активность и коллоидная стабильность нанозонда, и показано, что в процессе выполнения работ нами были получены образцы функционально-активного нанозонда специфичного к опухолевому маркеру Her2.

Иностранным партнером протестирована цитотоксичность ИК-КТ, имеющих химический состав CuInS2/ZnS и Ag2S/AgInS2/ZnS, флуоресцирующих в около-инфракрасной области была изучена с использованием линии клеток эпителия печени человека THLE-2 и в в модельных экспериментах in vivo. Показано, что поскольку в состав CuInS2/ZnS и ИК-КТ Ag2S/AgInS2/ZnS тяжелые металлы не входят, токсический эффект обоих видов ИК-КТ оказался довольно низким во всех использованных концентрациях.

Разработана методика испытаний нанозондов на основе конъюгатов ИК-КТ с одАТ, специфичными к опухолевому маркеру HER2, в культурах модельных линий клеток человека in vitro. Достигнута высокая специфичность связывания диагностических нанозондов с исследуемыми модельными клетками, экспрессирующими опухолевый маркер HER2, что позволяет использовать данные нанозонды для высокочувствительной дифференциальной диагностики рака при иммуногистохимическом анализе биоптатов опухолей. Разработаны рекомендации по методике испытаний нанозондов в культурах клеток. Данные рекомендации позволяют оптимизировать результаты, полученные при проведении испытаний нанозондов на основе конъюгатов ИК-КТ с одАТ, специфичными к опухолевому маркеру HER2, в культурах раковых клеток, экспрессирующих маркер HER2 и достигнуть высокой чувствительности детекции. Разработаны СОП по синтезу ИК-КТ состава CuInS2/ZnS и Ag2S, которые  показали хорошую воспроизводимость параметров  нанокристаллов с сохранением геометрических размеров, положения максимума флуоресценции и квантового выхода флуоресценции в различных синтезах.

Иностранным партнером выполнен сравнительный анализ по специфичности и соотношении сигнал/шум при использовании нанозондов на основе конъюгатов. Показано высокое соотношение сигнала к шуму, то есть значительная диагностическая чувствительность нанозонда

Полученные результаты позволяют разработать фундаментальные принципы создания компактных высокоэффективных диагностических нанозондов нового поколения, применимых в высокочувствительной диагностике и прижизненной визуализации онкомаркеров, опухолевых очагов и метастазирующих клеток при онкологических заболеваниях, а также оценить токсические эффекты высокоориентированных конъюгатов одАТ и ИК-КТ в модельных экспериментах in vivo и in vitro.

 

 

Результаты исследования

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты:

1. Осуществлен синтез биосовместимых инфракрасных квантовых точек состава CuInS2/ZnS и Ag2S и разработана методика солюбилизации инфракрасных квантовых точек, полученных от иностранного партнера. Также была разработана методика стабилизации квантовых точек флюресцирующих в инфракрасном диапазоне в водных растворах.

3. Разработана методика получения модифицированных рекомбинантных однодоменных антител, специфичных к опухолевому маркеру HER2, по которой были получены модифицированные рекомбинантные однодоменные антитела, специфичные к опухолевому маркеру HER2.

4. Разработана методика ориентированной конъюгации модифицированных рекомбинантных однодоменных антител с квантовыми точками, флуоресцирующими в инфракрасной области, по которой были получены ориентированные конъюгаты модифицированных рекомбинантных однодоменных антител с квантовыми точками, флуоресцирующими в инфракрасной области.

5. Получены результаты по анализу цитотоксичности солюбилизированных квантовых точек в модельных экспериментах in vitro и in vivo.

6. Разработана и проведена методика испытаний нанозондов на основе конъюгатов инфракрасных квантовых точек с однодоменными антителами, специфичными к опухолевому маркеру HER2, в культурах модельных линий клеток человека in vitro: линии клеток рака молочной железы SK-BR-3 с повышенным уровнем экспрессии опухолевого маркера HER2 и контрольной линии аденокарциномы молочной железы MCF-7. В ходе проведения методики были разработаны рекомендации по методике испытаний нанозондов в культурах клеток, позволяющие оптимизировать результаты испытаний и достигнуть высокой чувствительности детекции.

7. Разработаны СОП по синтезу ИК-КТ состава CuInS2/ZnS и Ag2S, характеризующихся высокой воспроизводимостью геометрических размеров, оптических свойств и химических свойств поверхности.

8. Иностранным партнером выполнен сравнительный анализ по специфичности и соотношении сигнал/шум при использовании для визуализации культур клеток с помощью нанозондов на основе конъюгатов ИК-КТ с однодоменными антителами к опухолевому маркеру HER2.

9. Разработана методика испытаний нанозондов на основе конъюгатов ИК-КТ с однодоменными антителами анти-HER2 в животных моделях in vivo. Разрабатываются рекомендации по визуализации раковых опухолей в живых организмах с ее помощью, а также критерии оценки полноты выполнения проекта. 

10. Иностранным партнером выполнен сравнительный анализ специфичности и соотношения сигнал/шум при использовании нанозондов на основе конъюгатов инфракрасных квантовых точек и однодоменных антител для визуализации опухолевого маркера HER2 в культурах клеток человека. Проводится характеризация нанозондов на основе конъюгатов ИК-КТ для их использования при визуализации опухолей в живом организме.

Практическая значимость исследования
Разработка фундаментальных принципов создания компактных высокоэффективных диагностических нанозондов нового поколения позволит повысить чувствительность и специфичность прижизненной диагностики и визуализации злокачественных и доброкачественных опухолей, разработать и обеспечить эффективные программы своевременной медикаментозной и хирургической терапии.