14.607.21.0156

Создание и испытание высокоэффективных химерных Т-клеточных рецепторов на основе одноцепочечных антител для проведения клеточной иммунотерапии онкопатологий
Разработка системы быстрого поиска высокоаффинных одноцепочечных антител, специфичных к опухолевым антигенам, при помощи РНК-дисплея из наивной библиотеки фрагментов антител альпаки
Идентификация новых опухолеспецифичных антигенов рака молочной железы, пригодных для осуществления направленной иммунотерапии
Исследование возможности комбинации направленной клеточной иммунотерапии новообразований в сочетании с вирусными онколитиками

Успешная Т-клеточная терапия - это высокоперсонализированный метод лечения, для проведения которого всегда необходимо либо создание нового, либо точный подбор уже созданного опухолеспецифичного рецептора. Использование персонализированной терапии злокачественных новообразований упирается в два ограничения – стоимость проведения терапии одного пациента и время, необходимое для создания эффективного препарата. Для большинства новых подходов второй фактор часто оказывается даже более лимитирующим, поскольку скорость прогрессии заболевания может превышать скорость получения персонализированного терапевтического средства. Для терапии модифицированными Т- лимфоцитами оба этих фактора одинаково применимы – время получения нового средства может быть весьма большим из-за долгого процесса селекции подходящего антитела, а на стоимость терапии негативно влияет большое количество экспериментальных работ по подбору вариабельной части, не имеющей проблем с растворимостью, иммуногенностью и кросс- реактивностью. Для успешного развития адоптивной Т-клеточной терапии необходимо разработать технологию, позволяющую получать высокоэффективные химерные рецепторы в течение короткого времени и с низкой стоимостью работ. Настоящий проект как раз направлен на разработку такой технологии.

Задача проекта - создание технологии быстрого получения высокоселективного химерного рецептора против антигенов, присутствующих на опухолевых клетках пациента. Её решение требует создания серии генетических конструкций для проведения трансдукции и экспрессии химерного рецептора в Т-лимфоцитах. Персонализация противоопухолевого препарата будет проводиться путем замены антиген-распознающей части рецептора, при этом трансмембранная часть и эндодомен у различных препаратов будут общими. Чтобы полученные препараты обладали максимальной эффективностью и приводили к активации модфицированных лимфоцитов будет определена оптимальная структура этих областей с использованием антигенраспознающих VHH-фрагментов верблюжьих антител и вариантов эффекторного эндодомена, содержащих различные сочетания активирующих сигналов. Подбор оптимальной структуры эндодомена будет проводиться с использованием в качестве антиген-распознающей части VHH-фрагмента антитела к опухолевому рецептору ERBB2. Будет проведен подбор оптимальной схемы культивации и трансдукции выделенных из пациента фракций Т-лимфоцитов, а также определен фенотип фракции, культивация которой приводит к получению наиболее эффективного клеточного препарата. Фракции CD8+ T-лимфоцитов будут разделены в зависимости от экспрессии поверхностных молекул CD45RA, CD95, IL-2rbeta, CCR7 и CD62L, и каждая из них проанализирована на продолжительность пролиферации и интенсивность противоопухолевого действия. Также, в ходе отработки условий култивации будет определена оптимальная длительность экспансии ex vivo, доза стимулирующих цитокинов и проведен подбор дополнительных цитокиновых стимулов, таких как IL15 и IL21. После определения оптимальных условий селекции, культивации и трансдукции, варианты химерного рецептора, различающиеся структурой эндодомена будут протестированы in vivo на иммуносупрессированных мышах с трансплантированными опухолями, экспрессирующими целевой антиген ERBB2 (линии HCC1954 либо SK-BR3). Планируется создание наивной (неиммунной) библиотеки варибельных фрагментов антител высокой сложности, позволяющей проводить поиск и идентификацию высокоаффинных последовательностей против целевых антигенов in vitro без необходимости проведения иммунизации животных, что позволит существенно сократить сроки получения новых химерных рецепторов для персонализированной терапии. Для снижения временных затрат, а также исключения фактора случайности при анализе результатов селекции, будет разработан метод селекции из наивной библиотеки с использованием технологий глубокого секвенирования. Он позволит снизить число раундов селекции, что ускорит ее проведение, а также исключит вероятность потери хороших клонов в ходе идентификации индивидуальных последовательностей. Проведение всего цикла работ по селекции оптимального фрагмента, последующему созданию химерного рецептора, получению фракций противоопухолевых Т-лимфоцитов и их тестированию in vivo на иммунодефицитных мышах с привитыми опухолями необходим для проверки работоспособности разработанной методики. Такая проверка будет проведена с использованием модельного антигена MUC1, широко представленного в различных опухолях молочной железы. Наиболее перспективные последовательности VHH-фрагментов антител к MUC1 будут протестированы на специфичность связывания с антигеном в составе химерного рецептора в Т-лимфоцитах на клеточных линиях рака молочной железы и in vivo на мышиной модели с привитыми опухолями. Будет разработан способ биоинформатического поиска и идентификации новых раковых антигенов методом глубокого секвенирования транскриптомов опухолевых образцов. Для идентифицированных антигенов будет проведена симуляция загрузки фрагментов на комплексы гистосовместимости первого и второго типов и подобраны оптимальные фрагменты антигенов, обеспечивающие наилучшее соотношение селективности и представленности на опухолевых клетках. Идентифицированные таким образом антигены будут использованы для создания новых Т-клеточных рецепторов. Для каждого из полученных пар образцов опухоль-нормальная ткань будет идентифицирован оптимальный с точки зрения создания химерного рецептора антиген и проведены работы по получению VHH-фрагмента и химерного рецептора на его основе, и последующему получению фракций противоопухолевых Т-лимфоцитов, которые будут протестированы на функциональную активность in vivo с использованием первичных опухолевых культур, полученных из исходного резекционного материала.

В рамках теоретических работ по проекту выполнен аналитический обзор современной научно-технической литературы, затрагивающей проблему исследования. Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Разработаны варианты возможных решений задачи, выбран и обоснован оптимальный вариант решения задачи. В ходе экспериментальных работ была создана генетическая конструкция для экспрессии химерного Т-клеточного рецептора в Т-лимфоцитах. Отработаны условия проведения трансдукции Т-лимфоцитов для получения CAR-экспрессирующей клеточной популяции. Произведен забор генетического материала альпак (периферических В-лимфоцитов) путем резекции периферического лимфоузла. Осуществлено выделение мононуклеарной фракции из образцов крови. Проведена пробоподготовка и глубокое секвенирование транскриптомов резекционного материала РМЖ.

Будет разработана новая технология быстрого получения высокоселективного химерного рецептора против антигенов, присутствующих на опухолевых клетках пациента. Её ключевыми особенностями будут использование неиммунной библиотеки вариабельных фрагментов антител верблюжьих для проведения селекции высокоаффинных последовательностей, использование высокопроизводительного секвенирования ампликонов для ускорения проведения селекции и массированной количественной оценки характеристик большого числа последовательностей-кандидатов, а также применение глубокого секвенирования транскриптомов опухолей для идентификации антигенов, пригодных для использования в качестве мишеней химерных рецепторов для проведения адоптивной Т-клеточной иммунотерапии. Будет сконструирован и протестирован химерный Т-клеточный рецептор, содержащий антиген-распознающую область на основе VHH-фрагмента одноцепочечного антитела альпаки и эндодомен. Его структура будет обеспечивать высокоселективное узнавание трансгенными Т-лимфоцитами опухолевых клеток, несущих молекулярную мишень – лиганд VHH-антитела, и приводить к быстрой активации цитотоксического действия Т-лимфоцитов в отношении опухолевых клеток. Будут разработаны методики выделения, культивации, экспансии популяций Т-лимфоцитов пациента и лентивирусной трансдукции в них экспрессионных кассет с химерным рецептором, которые обеспечат быстрое получение популяций трансгенных противоопухолевых Т-лимфоцитов для проведения адоптивной Т-клеточной терапии в препаративных количествах. Будет проведена идентификация новых антигенов с использованием разработанной технологии и получены высокоселективные химерные рецепторы и популяции противоопухолевых Т- лимофцитов. Популяции Т-лимфоцитов с химерными рецепторами будут испытаны в качестве носителей для доставки к опухолевым клеткам онколитических вирусов, что позволит в перспективе применять схемы на основе адоптивной Т-клеточной терапии и онколитической вирусной терапии для повышения совокупной эффективности терапии одного из самых распространенных злокачественных новообразований – опухолей молочной железы, что в перспективе может привести к снижению смертности от этого социально-значимого заболевания.