Регистрация / Вход
Прислать материал

14.579.21.0018

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.579.21.0018
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Название доклада
Разработка методологии доклинической оценки биотрансформации и гепатотоксичности лекарственных средств в системах in vitro с имитацией микроциркуляции
Докладчик
Полозников Андрей Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1. Разработать методологию доклинических исследований гепатотоксичности и биотрансформации лекарственных средств in vitro, основанную на гистотипических трехмерных клеточных моделях печени человека, культивируемых в условиях имитации микроциркуляции, позволяющую получить достоверные данные о безопасности лекарственного средства для здоровья человека, исследовать метаболизм ксенобиотиков в краткосрочных лабораторных тестах без использования лабораторных животных.
2. Разработать необходимый для ее реализации специализированное микрофлюидное устройство, обеспечивающее проведение стандартизованных однотипных одномоментных независимых исследований, количество которых достаточно для получения статистически достоверных результатов.
Актуальность и новизна исследования
Для облегчения вывода из организма ксенобиотики, как правило, превращаются в более гидрофильные вещества. Эта биотрансформация может влиять на биологическую активность ксенобиотика: в результате превращения может произойти как инактивация, так и повышение токсичности исходного вещества, а также образование метаболита более токсичного, чем исходное вещество. Для определения метаболитов новых соединений доклинические исследования в настоящее время проводятся на животных. Однако данный подход не гарантирует отсутствия токсичности в дальнейшем для человека в связи с наличием серьезных видоспецифических различий, главным из которых является изоферментный профиль, уровень экспрессии и активность цитохромов Р450. Сравнение профиля экспрессии и активности 9-ти изоформ CYP450 в микросомах печени мыши, крысы, кролика, собаки, обезьяны и человека показывает что ни один из видов даже приблизительно не описывает профиль активностей этих ферментов у человека. Также было показано, что экстраполяция данных полученных на животных возможна только для лекарственных соединений, метаболизируемых изоформой цитохрома CYP2E1. Изоформы CYP1A, CYP2C, CYP2D и CYP3A являются видоспецифичными.
Половина лекарственных средств, отозванных с рынка за последние три декады в связи с гепатотоксичностью, не проявляла таковой при доклинических испытаниях на животных. Для успешного предсказания гепатотоксичности используемых или разрабатываемых лекарственных средств наиболее перспективными считаются альтернативные in vitro тесты с использованием максимально адекватных клеточных моделей печени человека (КМПЧ), культивируемых в условиях микроциркуляции питательной среды.
Описание исследования

Клетки HepaRG культивировали в полной питательной среде (ППС) (Williams' Medium E (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Thermo Scientific, США), 5 мкг/мл рекомбинантного инсулина человека (Gibcо, США), 5х10-5 М гидрокортизона гемисукцината (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США)). Клетки дифференцировали в ППС с добавлением 2% ДМСО в течение 14 дней, а затем формировали сфероиды в 96-луночных планшетах с низкой адгезией и U-образным дном в течение 5 дней. После 5 дней формирования сфероиды переносили в бессывороточную питательную среду и инкубировали еще сутки . В состав бессывороточной питательной среды входят: William`s E c добавлением L-глутамина (Gibco, США), 1х Insulin-Transferrin-Selenium (Thermo Scientific, США), 1 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma, Германия), 5х10-5 М гидрокортизона гемисукцината (Sigma, США), 1х заменимых аминокислот (NEAA, Thermo Scientific, США), 1% пенициллин/стрепомицина (Gibco, США). Культивирование образцов КМПЧ проводили в МБР и сменных клеточных блоках.

Для проведения исследований гепатотоксичности использовали бессывороточную культуральную среду (БПС): William`s E (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 1 мг/мл альбумина сыворотки крови человека (Sigma, США), питательной добавки, состоящая из инсулина, трансферрина и селена (5.5 мкг/мл инсулина, Gibco, США), несущественных аминокислот (Gibco, США), 50 мкМ гидрокортизона гемисукцината (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США).

В ячейки для культивирования клеток МФУ вносили по 10 образцов КМПЧ (что соответствовало 50 тыс. клеток HepaRG), затем из ячеек отбирали питательную среду и вносили по 125 мкл раствора контрольного вещества (в БПС) в исследуемых концентрациях (экспериментальные образцы) или БПС (контрольные образцы). Инкубировали в течение 48 ч в СО2- инкубаторе при режиме работы МБР 5 Гц ± 10 кПа. Затем выполняли цитотоксический тест с нейтральным красным (НК) и МТТ.

В первую очередь для определения диапазона гепатотоксических концентраций проводили тест с размахом выборки. Максимальная используемая концентрация тестируемого вещества была 100 мМ для хорошо растворимых веществ или максимально растворимая в культуральной среде. 

После проведения теста с размахом выборки для определения концентрации полумаксимального ингибирования IC50 выполняли определяющий тест. Для этого анализировали влияние 6 концентраций тестируемого вещества, разведенного в БПС в диапазоне, установленном в тесте с размахом выборки, на жизнеспособность образцов КМПЧ. 

При исследовании биотрансформации в ячейки для культивирования клеток сменного клеточного блока (СКБ) МБР вносили по 100 образцов КМПЧ, затем из ячеек отбирали питательную среду и вносили по 125 мкл среды, содержащей субстратную смесь цитохромов P450 (10 мкМ бупропиона, 10 мкМ тестостерона, 40 мкМ толбутамида, 20 мкМ омепразола) в отсутствие ингибиторов и в присутствии каждого из специфических ингибиторов в концентрациях, указанных в таблице 1, и в присутствии 1 мкМ тестируемого вещества. 

В качестве контроля использовали 1 мкМ тестируемого вещества в отсутствие панели субстратов-ингибиторов. Культивирование проводили в течение 24ч при частоте работы клапанов 5 Гц и давлении  ± 10 кПа, затем из каждого СКБ было отобрано 100 мкл среды, к которым добавляли 35 мкл охлажденного до -20°С ацетонитрила и проводили хроматомасс-спектрометрический анализ для определения метаболитов исследуемых веществ. Также были определены концентрации тестостерона, 6-гидрокси бупропиона, 4-окситолбутамида и 3-оксиомепразола в исследуемых средах.

Разделение проводили на ВЭЖХ колонке ZORBAX Eclipse Plus C18 4,6 мм × 150 мм, 5 мкм (Agilent, США) при скорости потока 1 мл/мин и Т= 40°С и градиентном режиме: 0-3 мин – 100 % фазы А (0,425 об.% муравьиной кислоты в 5% растворе ацетонитрила в воде), 3-11 мин – линейный градиент от 100 до 60 % фазы А, 11-13 мин – линейный градиент от 60 до 0 % фазы А, 13-15 мин – 0 % фазы А, 15-18 мин – линейный градиент от 0 до 100 % фазы Б, 18-21 мин – 100 % фазы Б (0,425 об.% муравьиной кислоты в ацетонитриле).

Детекция продуктов биотрансформации проводилась на хроматомасс-спектрометре LCMS 8030 (Shimadzu, Япония).

 

Результаты исследования

Получены экспериментальные образцы КМПЧ, культивированные в условиях планшета и микробиореактора и разработан протокол получения клеточной модели печени на основе сфероидов клеток линии HepaRG.

Исследовано влияние перфузии культуральной клеточной среды, имитирующей микроциркуляцию, на жизнеспособность и метаболическую активность клеточной модели печени.

Разработаны методики определения гепатотоксичности и биотрансформации лекарственных средств в системах in vitro с имитацией микроциркуляции.

Проведено исследование гепатотоксического действия ацетаминофена на клеточной модели печени человека 
(КМПЧ). Для регистрации токсического повреждения была выбрана оценка жизнеспособности КМПЧ (IC50) с помощью методов МТТ и окрашивания НК. Для оценки информативности разработанной методики были выбраны изониазид и метформин. Полученные значения IC50 согласуются с известными показателями исследований токсичности in vivo (LD50).
Для отбора оптимального режима работы МБР проведено сравнительное исследование активности цитохромов Р450 и P-гликопротеина в КМПЧ. Для разработки методики оценки биотрансформации в качестве 
субстратов/ингибиторов были выбраны для CYP2B6 – бупропион/PPP, CYP2C9 – толбутамид/сульфафеназол, CYP2C19 – омепразол/NBN, а  CYP3A4 – тестостерон/кетоконазол. Полученные результаты по оценке биотрансформации контрольных лекарственных средств, дазатиниба и варфарина, согласуются с литературными данными.

Проведены многоцентровые международные испытания разработанных методик исследования гепатотоксичности и биотрансформации лекарственных средств in vitro на примере четырех лекарственных средств:  амиодарона, вориконазола, росиглитазона и циклофосфамида.

Проведено обоснование конструкции микрофлюидного устройства (МФУ). Были разработаны эскизный проект МФУ и программы и методики испытаний макета МФУ. Был изготовлен макет МФУ. Устройство позволяет проводить культивирование не менее 4-х однотипных КМПЧ в условиях независимых замкнутых контуров с циркулирующей питательной средой. Каждый замкнутый контур обладает одной клеточной ячейкой для культивирования КМПЧ. Диапазон расходов питательной среды в МФУ составляет от 0.2 мкл/мин до 76 мкл/мин. Каждый замкнутый контур МФУ имеет демпфирующий элемент – гибкую эластичную мембрану, которая обеспечивает плавное изменение давления в клеточной ячейке. В результате проведенных экспериментальных испытаний было показано, что качество и функциональность изготовленных макетов МФУ соответствуют установленным требованиям.

Практическая значимость исследования
Применение максимально адекватных клеточных моделей печени человека (КМПЧ), культивируемых в условиях микроциркуляции питательной среды позволит более точно определять гепатотоксичность и пути биотрансформации используемых или разрабатываемых лекарственных средств.