Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0086

Аннотация скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0086
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов
Докладчик
Сергиев Петр Владимирович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является создание высокоэффективной системы поиска новых антибиотиков, позволяющей сразу, на этапе скрининга антибактериальной активности определять мишень – биосинтез белка. В результате будут созданы наборы для высокопроизводительного тестирования на основе специального штамма-репортера, который начинает синтезировать флюоресцентный белок при остановке белок-синтезирующей системы. Разрабатываемая система может быть внедрена на предприятиях, занимающихся высокопроизводительным скринингом лекарственных препаратов.
Актуальность и новизна исследования
Хотя в настоящее время на вооружении медицины стоит несколько эффективных классов антибактериальных препаратов, среди патогенных бактерий наблюдается непрерывный рост числа изолятов, устойчивых к тем или иным классам антибиотиков. Более того, обнаруживаются штаммы со множественной и даже всеобъемлющей устойчивостью. Считается, что более половины известных антибиотиков подавляют биосинтез белка и связываются с рибосомой. В настоящее время поиск антибактериальных препаратов проводится по традиционной схеме. Сначала широкий набор культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов тестируется на антибактериальную активность. В этом тестировании участвуют тысячи образцов. Затем, из образцов, имеющих антибактериальную активность, выделяют активное соединение, проводят анализ его строения и только затем изучают механизм действия. Подобная схема далека от оптимальной. Изучение механизма действия приходится начинать «с чистого листа», не имея представления о том, на какой процесс может влиять данное антимикробное соединение. Использование репортерных штаммов бактерий, изменяющих экспрессию гена флюоресцентного белка в ответ на ингибирование одного из внутриклеточных процессов, позволит уже на этапе первичного скрининга выявлять молекулярную мишень антибактериального препарата. Подобная схема также позволит значительно ускорить определение механизма действия антибактериальных препаратов. Для тестирования не менее 10 000 соединений потребуется модернизация метода поиска новых антимикробных препаратов, ингибирующих биосинтез белка, для применения в высокопроизводительном (роботизированном) формате.
Описание исследования

Создан двойной репортерный штамм (pDualrep2) на основе двух флуоресцентных белков, которые можно детектировать независимо. Количество одного из белков зависит от присутствия антибиотиков, вызывающих замедление трансляции, количество второго увеличивается в присутствии ДНК-повреждающих агентов. Были выбраны два белка – RFP и Katushka2S, так как их можно независимо детектировать при помощи системы ChemiDoc. Была показана высокая чувствительность данной системы. Возможно детектировать контрольные антибиотики в количестве, меньшем или равным 1 мкг, сигнал проявляется за 16 часов и остается постоянным и не меняется по меньшей мере до 72 часов.

При помощи разработанной системы поиска антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка было протестировано 10 368 соединений. Образцы наносились на поверхность агара с репортерным штаммом при помощи 96-канальной пипетирующей головки роботизированной станции Janus. Отбирались соединения, вызывающие индукцию репортерного штамма.

Для отобранных соединений была проведена проверка механизма действия при помощи внеклеточной системы биосинтеза белка (in vitro трансляции) в бактериальном экстракте. Для in vitro трансляции использовали мРНК белка люциферазы светлячка (Fluc), так как синтезированную во внеклеточной системе люциферазу легко детектировать по специфической реакции с субстратом (люциферин).

Результаты исследования

В ходе скринига были отобраны 22 соединения, индуцирующие экспрессию гена katushka2S. Для этих соединений была проведена проверка механизма действия при помощи внеклеточной системы биосинтеза белка (in vitro трансляции) в бактериальном экстракте. В то время, как соединения 113A4 и 133F2 сильно отличаются друг от друга и от остальных соединений выборки, соединения 114G8, 122H12, 114A9, 122C9, 114B9, 122H8, 114G11, 122D9, 114H11, 117H9 и 120E10 родственны между собой и имеют общий гуанидино-хиназолиновый или гуанидино-пиримидиновый каркас. В связи с этим, решено было для дальнейшей работы использовать три соединения, представляющие собой независимые классы, а именно соединения 113A4, 133F2  и 114G8.

Обнаруженное в результате скрининга соединение, N-(пиридин-3-илметил)акридин-9-амин, идентификационный номер 3232-0463,  описано в научной литературе. Из публикаций известна его антибактериальная (Торгун и соавт., Антибиотики и химиотерапия, 2001) и противовирусная активность (патент US2009221624). Vеханизм действия этого соединения не известен из научной литературы. Не сообщалось также о влиянии данного соединения на биосинтез белка. Наличие ароматических систем, доноров и акцепторов водородных связей, а также положительного заряда, позволяет предположить, что соединение может образовывать как стекинг-взаимодействия с основаниями РНК, так и образовывать водородные связи с функциональными группами РНК и белков. Весьма возможно также образование солевых мостиков с фосфатными группами РНК.

Соединение 3389-0165,  обнаруженное при скрининге, как индуцирующее экспрессию репортерного гена Katushka2S,  2-(8-этокси-4-метилхинозолин-2-ил)гуанидин представляет целый класс гуанидино-хиназолинов или гуанидино-пиримидинов. Из анализа научной литературы известно, что вещество 3389-0165 способно ингибировать рост возбудителя тропической малярии Plasmodium falciparum при инфицировании эритроцитов (Plouffe D., et al., PNAS (2008) v. 105 p. 9059-9064). Также сообщалось об активности данного соединения, как антагониста аденозинового рецептора А1 человека (Cheng F. et al., Eur J Med Chem. (2010) v. 45 p.3459-3471). Данных об ингибировании  соединением 3389-0165 биосинтеза белка в научной литературе не было обнаружено. Также как и первое из обнаруженных в результате скрининга соединений, соединение 3389-0165 содержит ароматические кольца, способные образовывать стекинг взаимодействия с гетероциклическими основаниями РНК, многочисленные доноры и акцепторы водородных связей, а также положительный заряд, способствующий образованию солевых мостиков с фосфатными группами РНК.

Третье соединение вызывающее активацию экспрессии репортерного гена Katushka2S, имеет название 2-гидроксиэтил-(6-метил-2-фенилхромен-4- илиден) азаниум, порядковый номер 6197-4999. Из научной литературы известно о способности данного соединения ингибировать размножение вируса коровьей оспы в результате подавления его репликации (Ciustea M., et al., J Med Chem. (2008) v. 51. p. 6563-6570; патент US2013338117). В научной литературе отсутствуют данные об ингибировании соединением 6197-4999 биосинтеза белка. Показательно, что и третье соединение по своим свойствам очень похоже на первые два. Соединение может образовывать стекинг-взаимодействия с основаниями РНК, водородные связи и солевые мостики с фосфатными группами РНК.

Практическая значимость исследования
Модернизированный метод поиска новых антимикробных препаратов, ингибирующих биосинтез белка, для применения в высокопроизводительном (роботизированном) формате будет применяться для широкомасштабного поиска новых антибиотиков в научных учреждениях и фармкомпаниях.
Новые препараты, ингибирующих биосинтез белка, после оптимизации их структуры для поиска наиболее активных производных, будут коммерциализоваться с помощью продажи лицензий, в том числе эксклюзивных, на использование соединений.
Презентация

Presentation_Sergiev.ppt