Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0118

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0118
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Разработка комплексных тест-систем на основе массированного секвенирования генов Т- и B-клеточного рецептора для мониторинга минимальной остаточной болезни при терапии острых лейкозов у детей
Докладчик
Лебедев Юрий Борисович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта: разработка комплексных тест-систем для мониторинга минимальной остаточной болезни при терапии острых лейкозов у детей.
Основные задачи:
- разработка методов идентификации молекулярно-генетических маркеров, влияющих на выбор персонифицированной лекарственной или трансплантационной терапии при острых лейкозах у детей;
- разработка тест-систем для индивидуализации лекарственной или трансплантационной терапии острых лейкозов у детей на основе определения молекулярно-генетических характеристик;
- разработка специализированного программного обеспечения обработки результатов массированного секвенирования генов Т- и В-клеточных рецепторов для количественной оценки уровня минимальной остаточной болезни обследуемых пациентов.
Актуальность и новизна исследования
- Актуальность:
Высокоточное и высокочувствительное определение минимальной остаточной болезни (МОБ) – индивидуальных клонов опухолевых лимфобластов – у пациентов с острыми лейкозами представляет одну из наиболее острых проблем современной онкогематологии. Поскольку даже незначительное количество опухолевых клеток лимфобластных клонов обуславливает высокий риск рецидива заболевания, мониторинг МОБ абсолютно необходим для выбора эффективных индивидуализированных программ лечения острых лейкозов в современной клинической практике.
- Новизна:
Сочетание углублённого структурного анализа V(D)J-перестроек в генах Т- и В-клеточных рецепторов в клетках диагностических образцов и лейкоцитарных фракций крови пациентов с применение массированного секвенирования ДНК лейкоцитов является наиболее перспективным подходом к разработке инновационных технологий мониторинга МОБ при острых детских лейкозах.
Описание исследования

Проведенное исследование включало: а) формирование комплексного набора олигонуклеотидных праймеров для одновременной амплификации всех наличествующих в юиологическом образце перестроек V(D)J районов основных локусов иммуноглобулиновых рецепторов: TRB, TRD, TRG, IgH, IgK, IgL; б) оптимизацию системы пробоподготовки к массированному секвенированию и условий проведения мультиплексной ПЦР анализируемых локусов генома лейкоцитарных клеток; в) совершенствование способов количественной оценки уровня минимальной остаточной болезни (МОБ) в клинических образцах костного мозга и крови больных с острыми детскими лейкозами; г) разработка и применение специализированного пакета программного обеспечения для исчерпывающего сравнительного анализа результатов массированного секвенирования V(D)J-перестроек генома лейкоцитов при мониторинге МОБ.

Стандартизованная технология пробоподготовки клинических образцов к массированному секвенированию V(D)J-перестроек состоит в проведении серии последовательных ПЦР. На первом раунде ПЦР используются наборы смесевых праймеров, соответствующих V- и J-генам анализируемых локусов лимфоцитарных геномов. В ходе двух последующих раундов ПЦР-амплификации в полученные ампликоны вводятся нуклеотидные последовательности молекулярных идентификаторов и олигонуклеотидные фрагменты, необходимые для секвенирования на платформе Illumina.

С целью определения оптимального экспериментального подхода количественной оценки МОБ были апробированы три способа измерения концентрации опухолевых клеток в костном мозге пациента после проведения курса химиотерапии:

А) Использованием калибровочной прямой

Концентрация опухолевого клона в целевом образце определяется методом интерполяции или экстраполяции на калибровочной прямой, построенной в системе координат, где по оси X откладывается концентрация искомой опухоль-специфической V(D)J перестройки в анализируемом образце, а по оси Y в логарифмической шкале – число ридов, приходящихся на эту перестройку. Калибровочная прямая строится по трем точкам на основании данных секвенирования искомых перестроек в трех аликвотах ДНК из целевого образца (после терапии), содержащих вложенные контроли ДНК инициального образца в концентрации, соответствующей 10, 100 и 1000 опухолевых клеток на 100 000 нормальных клеток.

Б) Использование уникальных молекулярных идентификаторов.

На первом этапе амплификации в ампликоны анализируемых V(D)J-перестроек вводятся уникальные молекулярные идентификаторы (УМИ) как со стороны V-сегмента, так и со стороны J-сегмента. При этом на каждом цикле амплификации новый УМИ вводится только с одной из сторон – либо со стороны V-сегмента, либо со стороны J-сегмента. С помощью анализа сочетаний УМИ с обеих сторон в секвенированных молекулах реконструируются кластеры, отражающие амплификацию каждой целевой молекулы на старте, а по количеству кластеров определяется первоначальное число таких молекул.

В) Использование принципа Digital PCR.

Данный подход заключается в поиске опухоль-специфичной V(D)J-перестройки в серии аликвот ДНК из целевого образца костного мозга. Концентрацию опухолевых клеток определяют как отношение числа аликвот, в которых была обнаружена целевая V(D)J-перестройка к произведению числа клеток в каждой анализируемой аликвоте и числа аликвот, взятых в анализ. Два последних параметра подбираются, исходя из требуемого уровня чувствительности, составляющего 1 опухолевую клетку на 1 млн. проанализированных. При этом точное определение концентрации опухолевых клеток возможно при условии, что число аликвот, в которых обнаружена целевая перестройка существенно ниже общего числа анализируемых аликвот.

При определении эффективности каждого из вышеперечисленных способов проводилась биоинформатическая обработка результатов массированного секвенирования с помощью оригинального программного обеспечения «пакет Лейко-tCR». По сравнению с известными аналогами разработанное ПО содержит улучшенные либо принципиально новые алгоритмы и структуры данных для поиска последовательностей клеточных рецепторов среди массивов секвенирования и новые методы для анализа и сравнения репертуаров клеточных рецепторов по разнообразию репертуаров, по использованию генных сегментов в рецепторах и наличию общих рецепторов и ряд других характеристик и приемов, обеспечивающих высокую информативность результатов биоинформатического анализа.

Результаты исследования

Основные результаты выполнения проекта включают:

1) Создание и апробацию новых диагностических тест-систем, сочетающих использование ранжированного набора специализированных олигонуклеотидных ПЦР-праймеров и оригинальных модификаций высокотехнологичных молекулярно-биологических методов:

Выполненные оптимизация структур ПЦР-праймеров, компоновка праймеров к различным V/J генам и оптимизированный способ ранжирования смесевых праймеров обеспечили достижение высокой универсальности тест-системы - возможности идентификации по крайней мере одного информативного маркера у каждого пациента; при этом, в клинических образцах свыше 70% обследованных пациентов идентифицировано наличие двух и более опухолевых маркеров. Применение оригинальная системы пробоподготовки, включающее двойное бар-кодирование каждой секвенируемой молекулы V(D)J-перестройки, позволило гарантировать однозначную идентификацию опухолевого маркера и высокоточное определение МОБ.

2) Экспериментальную верификацию высокой чувствительности комплексной тест-системы, основанной на использовании оригинального подхода к измерению минимальной остаточной болезни, который обладает:

- высокой специфичностью выявляемого маркера и чувствительность его детекции ¾ способность идентификации одной опухолевой из 100 000 клеток диагностических пунктатов костного мозга или из 1 миллиона лейкоцитов образцов крови обследованных пациентов;

- стабильностью детектируемого маркера для каждого опухолевого клона и каждого пациента;

- надёжностью методики детекции опухолевого маркера и воспроизводимостью результатов как идентификации, так и уровня МОБ;

3) Разработку уникального пакета программного обеспечения для высокоточного комплексного количественного анализа клональной вариабельности лимфоцитов организма человека (пакет Лейко-tCR). Применение пакета Лейко-tcR, использующего язык статистических вычислений R, обеспечило углубленный анализ и исчерпывающую характеристику полного репертуара Т-клеточных и В-клеточных рецепторов в клинических образцах костного мозга и/или венозной крови, получаемых от пациентов с острыми детскими лейкозами при диагносцировании заболевания и в ходе проводимой в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева онкотерапии. Преимуществами пакета Лейко-tCR, по сравнению с другими специализированными ПО являются:

- поддержка разнообразных входных данных (MiTCR, MiXCR, MiGEC, VDJtools, ImmunoSEQ, IMSEQ).

- разнообразные фильтры для обработки данных, поиск мотивов в последовательностях CDR3.

- описательные статистики репертуаров.

- статистика по общим клонотипам среди репертуаров.

- сравнение репертуаров.

- статистики по V- и J-сегментам и их анализ.

- оценка разнообразия репертуаров.

- генерация искусственных репертуаров.

- разнообразные процедуры визуализации.

- сети мутаций для анализа похожих клонотипов и соматических гипермутаций иммуноглобулинов.

В совокупности основные результаты проведенного исследования а) обеспечили получение уникального массива данных о медико-биологических закономерностях развития минимальной остаточной болезни у детей с острыми лейкозами и б) позволили разработать  методические рекомендации и регламент применения разработанных тест-систем для проведения клинических анализов и составления технического задания и проведения НИОКР на базе Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева.

Практическая значимость исследования
1. Основными областями применения результатов проведенного исследования являются:
-здравоохранение - клинические центры и диспансеры, клинико-диагностические лаборатории, специализирующиеся на диагностике и лечении онкологических заболеваний крови;
-фундаментальная и отраслевая наука - научно-исследовательские организации, изучающие молекулярно-генетические аспекты возникновения, развития и терапии острых лейкозов.
2. Проектом предусмотрено проведение НИОКР на базе Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева. Внедрение разрабатываемых тест-систем в широкую клиническую практику позволит снизить долю неизлечимых пациентов и снизить уровень ранней инвалидизации детей, способствуя повышению эффективности отечественной медицины и качества жизни онкологических больных.
3. Успешное завершение проекта и использование разработанных инновационных тест-систем в медицинской практике способны существенно ускорить внедрение отечественными клиническими центрами современных способов персонифицированной лекарственной и трансплантационной терапии острых детских лейкозов.
4. Теоретически достижимые характеристики создаваемых тест-систем превосходят опубликованные к настоящему времени аналоги. За счёт высоких технических характеристик разрабатываемые тест системы имеют экспортный потенциал.