Регистрация / Вход
Прислать материал

14.575.21.0074

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.575.21.0074
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"
Название доклада
Разработка опто- и хемогенетических методов регистрации и коррекции нарушения нейрогенеза
Докладчик
Касымов Виталий Анварович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели: 1) На основе функциональных и/или генетически кодируемых сенсоров создать методы выявления нарушений нейрогенеза и средства его восстановления; 2) разработать средства стимуляции нейрогенеза.
Задачи: 1) создание генетической конструкции, на основе адено- и/или лентивирусных векторов, обеспечивающей контролируемую экспрессию генов в нейронах и астроцитах головного мозга; 2) разработка метода и создание протокола получения модифицированной первичной культуры астроцитов и нейронов головного мозга крыс, для использования при получении генетических конструкций для управляемой, избирательной активации или ингибирования клеточных функций; 3) проведение анализа сигнальных систем астроцитов и нейронов, их общего функционального статуса при генетической модификации; 4) разработка методических рекомендаций для дальнейшего использования разрабатываемой технологии контроля нейрогенеза в испытаниях на животных моделях нейродегенеративных заболеваний.
Актуальность и новизна исследования
Несмотря на значительные усилия, наши ограниченные знания механизмов функционирования головного мозга негативно сказываются на темпах разработок в данной области. Очевидно, это обусловлено чрезвычайной сложностью строения нервной системы в целом, и головного мозга в особенности. Его сложнейшая система, в которой миллиарды взаимосвязанных нейронов, астроцитов и других типов клеток, практически каждая из которых обладает своим набором уникальных характеристик, образует устойчивый механизм, обеспечивающий регуляцию жизнедеятельности организма и его связь с внешним миром. До сих пор не достигнуто достаточной глубины понимания молекулярных механизмов таких частых заболеваний как, например, болезнь Паркинсона, депрессия и шизофрения.
Участниками патогенеза всегда являются нейроны и клетки глии, в частности, астроциты. Согласно последним данным, астроциты принимают непосредственное участие в поддержании трансмиттероного и метаболического баланса, необходимого для нормального функционирования нейронов.
Вирус-индуцированные опто- и хемогенетические подходы обладают преимуществом высокого разрешения, которое на сегодняшний день достигает 1 мкм. Такое разрешение позволяет стимулировать подструктуры субталамического ядра, что в свою очередь, может служить не только инструментом для терапии, но мощным исследовательским подходом для понимания механизмов патогенеза неврологических нарушений.
Таким образом, разработка методик опто- и хемогенетического контроля в астроцитах и нейронах является перспективным направлением для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний.
Описание исследования

Порядок действий настоящих ПНИ, включающий описание и обоснование выбора методологических подходов:

Иммуногистохимический анализ уровня экспрессии глиотрансмиттеров и глиомодуляторов, ферментов и везикулярных транспортеров клеток астроглии из мозга с последующей визуализацией на сканирующем конфокальном микроскопе LSM 780 (Zeiss, Германия). Иммуногистохимический анализ представляет собой быстрый и высокорепрезентативный метод качественной и количественной оценки трансмиттерного и рецепторного профиля клеток. В комплексе со сканирующей конфокальной микроскопией и программным обеспечением обработки изображений иммуногистохимический анализ является неотъемлемым компонентом современных нейробиологических исследований, в том числе используемым для дополнительного подтверждения данных, полученных посредством транскриптомного и протеомного анализов.

Выделение астроцитов из разных областей коры посредством метода сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). FACS представляет собой эффективный метод выделения как живых, так и фиксированных клеток определённого типа из клеточной суспензии. Сортировка астроцитов производилась на клеточном сортере S3e (BioRad, США) с использованием астроцит-специфичных антител, меченных флуорофором. Использование клеточного сортера S3e (БФУ им. И. Канта) – это максимально автоматизированный и прецизионный метод выделения клеток. Астроциты, полученные из определённой области коры, затем направлялись на транскриптомный анализ, а также на обогащение клеточных культур.

Транскриптомный анализ астроцитов из мозга крысы с целью оценки их экспрессионного профиля. Транскриптомный анализ, в частности секвенирование, представляет собой набор инструментов и подходов для широкомасштабного анализа экспрессии генов, что позволяет оценить и сравнить уровни экспрессии определённых генов в астроцитах из разных зон коры головного мозга. Транскриптомный анализ астроцитов производился с использованием системы полногеномного секвенирования MiSeq (Illumina, США). MiSeq представляет собой производительный и компактный геномный секвенатор, позволяющий получать ДНК-кластеры на проточном чипе (твердофазная ПЦР) и проводить их секвенирование (sequencing by synthesis). Использование баркодов увеличивает возможности анализа до нескольких образцов за один запуск. MiSeq – это эффективная альтернатива капиллярному секвенированию с самой большой длиной прочтения ДНК среди секвенаторов нового поколения: 600 пар оснований.

Создание и применение генетических конструкций для трансфекции астроцитов с целью исследования изменений в α- и β-адренергических, пуринергических и G-белок зависимых сигнальных путях in vitro и in vivo. Использование генетических конструкций нашло широкое применение в нейробиологии за счёт возможности непосредственного и строго селективного влияния на сигнальные пути клетки, что позволяет, в частности, проведение оценки изменений профиля глиотрансмиттеров в астроцитах in vitro и in vivo в ответ специфическую активацию астроцитарных внутриклеточных каскадов.

Регистрация динамики кальция в астроцитах в норме и при трансфекции генетическими конструкциями посредством использования кальциевых индикаторов и сканирующей конфокальной микроскопии на LSM 780 (Zeiss, Германия). Использование кальциевых индикаторов является уникальной неинвазивной технологией регистрации клеточной активности и позволяет регистрировать изменения концентрации внутриклеточного кальция в реальном времени. Конфокальный сканирующий микроскоп LSM 780 с режимом измерения интенсивности флуоресценции объекта во времени и записи временных серий с заданными параметрами и разрешением является идеальным решением поставленной задачи.

Регистрация динамики кальция в астроцитах в норме и при трансфекции генетическими конструкциями посредством использования кальциевых индикаторов и сканирующей конфокальной микроскопии на LSM 780 (Zeiss, Германия). Использование кальциевых индикаторов является уникальной неинвазивной технологией регистрации клеточной активности и позволяет регистрировать изменения концентрации внутриклеточного кальция в реальном времени. Конфокальный сканирующий микроскоп LSM 780 с режимом измерения интенсивности флуоресценции объекта во времени и записи временных серий с заданными параметрами и разрешением является идеальным решением поставленной задачи.

Результаты исследования

В ходе выполнения ПНИ были получены следующие научно-технические результаты:

1 Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ, содержащие:

а) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме;

б) результаты анализа данных экспериментальных исследований;

в) обобщение и выводы по результатам ПНИ.

2 Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.

3 Экспериментальные образцы генетических конструкций на основе вирусных векторов:

- для трансфекции нейронов;

- для трансфекции астроцитов.

4 Лабораторный протокол создания генетических конструкций.

5 Лабораторный протокол специфической активации трансфецированных генетическими конструкциями нейронов и астроцитов.

6 Лабораторный протокол создания моделей культур клеток головного мозга (нейроны и астроциты) крыс.

7 Программа и методики испытаний экспериментальных образцов генетических конструкций в культурах клеток in vitro.

8 Лабораторный протокол трансфекции нейронов и астроцитов in vivo.

9 Программа и методики испытаний экспериментальных образцов генетических конструкций с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов in vivo.

10 Методика ингибирования и активирования катехоламинергических нейронов.

11 Лабораторный протокол ингибирования и активирования катехоламинергических нейронов.

12 Экспериментальные образцы наборов реагентов для моделирования стимуляции и восстановления нарушений нейрогенеза в головном мозге (наборы реагентов для моделирования нейрогенеза, далее – НРМН):

- НРМН для трансфекции нейронов;

- НРМН для трансфекции астроцитов.

13 Лабораторный технологический регламент изготовления НРМН.

14 Методика оценки эффективности экспериментальных образцов НРМН.

15 План исследований экспериментальных образцов НРМН для оценки их эффективности в экспериментах in vitro и in vivo.

16 Проекты инструкций по применению НРМН.

17 Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.

18 Проект технического задания на проведение ОТР по теме: Разработка опто- и хемогенетических методов регистрации и коррекции нарушения нейрогенеза. 

Конечным продуктом, созданным с использованием результатов, полученных при выполнении проекта, является набор реагентов для моделирования нейрогенеза, который должен удовлетворять следующим требованиям:

1) основа генетической конструкции – ленти- и/или аденоассоциированного вирусного вектора;

2) способ визуализации – химически и/или оптически;

3) размер экспериментального образца генетической конструкции – не более 25000 нуклеотидов/пар нуклеотидов;

4) специфичность к определенному типу клеток – 97%, не менее;

5) количество индуцируемых каскадов – 3, не менее;

6) токсичность – для применения in vivo (не токсично);

7) тип трансфецируемых клеток – дифференцированные. 

Таким образом, можно заключить, что научно-технический уровень результатов, полученных в ходе выполнения ПНИ, соответствует лучшим достижениям в данной области. Поставленные задачи выполнения прикладных научных исследований в целом решены полностью.

Практическая значимость исследования
Результаты, полученные в рамках выполнения данного ПНИ, будут использованы для создания нового типа генной терапии заболеваний, вызывающих деградацию нейронов и астроцитов. Особенностью данной технологии, основанной на вирусной трансфекции клеток, является возможность ее не инвазивного применения. Полученные результаты будут способствовать развитию соответствующих направлений технологической платформы «Медицина будущего» и национальной инициативы "Нейротехнологии": нейробиологии, клеточной биологии, синтетической биологии, новых систем для терапии на основе молекулярных и клеточных мишеней. Работа имеет ключевое значение в развитии нейротехнологий и биомедицины будущего и направлена на поиск способов и создание заделов для нового направления клеточной нейробиологии и нейротехнологий в медицине – управления внутриклеточными функциональными системами. Социально-экономический вклад в развитие общества может быть следующим: снижение экономической нагрузки на государство путем улучшения качества жизни и увеличения трудоспособности пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. Полученные результаты могут послужить основой международного сотрудничества с целью изучения роли астроцитов в норме и при патологии, в частности, при изучении нейродегенеративных заболеваний.
Постер

Poster_NZH_0074.ppt