Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0148

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0148
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран
Докладчик
Мойсенович Михаил Михайлович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель: Разработка нового биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток, вовлеченных в процессы регенерации
Задачи: Разработка научных, методических и технологических основ для создания биорезорбируемого микроносителя, предназначенного для инъекций клеток разных типов в область заживления и регенерации ран, включая выбор оптимального состава микроносителя для обеспечения формирования на его поверхности условий для адгезии и роста клеток, ускоряющих заживление и регенерацию; выбор способа получения микроносителя, обеспечивающего возможность проведения инъекций в область регенерации; определение влияния витализации микроносителя различными типами клеток и их смесями на скорость заживления ран и восстановление структуры ткани в модели полнослойных ран экспериментальных животных.
Актуальность и новизна исследования
Одним из наиболее перспективных направлений тканевой инженерии и регенеративной медицины в настоящее время является разработка, исследование и клиническое использование комплексов, состоящих из искусственного внеклеточного матрикса и клеток, использующих матрикс как субстрат в результате их нанесения и культивирования in vitro или спонтанного заселения in vivo. Особое внимание уделяется разработке подходов к регенерации труднодоступных органов и тканей. Принципиальная возможность создания универсального биорезорбируемого изделия в виде суспензии пористого микроносителя, способного поддерживать жизнеспособность клеток разных типов, позволяет прогнозировать заметный прорыв в области регенеративной медицины. В настоящее время уже используются разнообразные биорезорбируемые скаффолды для ускорения заживления и регенерации кожных ран, проводятся разработки композитных трансплантатов, однако многочисленные методологические проблемы, связанные с самой процедурой трансплантации, а также процессами спонтанной деградации до конца не решены. Использование микроносителей в том числе является альтернативной технологией заполнения и активации регенерации обширных повреждений кожи. Данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемыхмых микроносителей, загруженных культивированными кератиноцитами человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи. Таким образом, разработка биорезорбируемых материалов для создания суспензионных препаратов для эффективного лечения глубоких дефектов кожи является чрезвычайно актуальной задачей.
Описание исследования

Разработка микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов для решения задач тканевой инженерии и регенеративной медицины имеет значительный потенциал, как в фундаментальном, так и прикладном значении. Создаваемая микроносителями трехмерная среда роста для культивируемых клеток является важнейшим фактором их дальнейшего нормального функционирования после введения в область травмы или другого поражения. Повреждения кожи являются удобной моделью как для отработки методов введения биодеградируемых микроносителей, так и для изучения их влияния на скорость заживления и регенерации тканей. Микроносители – это частицы от 100 до 400 мкм в диаметре, которые изготавливаются из различных материалов и могут использоваться для прикрепления клеток и последующего введения в рану. В результате реализации проекта разработаны научно-технические основы для создания отечественного биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток, обеспечивающих ускорение репарационных процессов и процессов регенерации. В качестве основы для создания экспериментальных образцов микроносителя использован фиброин шелка - биополимер, обладающий впечатляющими механическими свойствами, в том числе высокой прочностью на разрыв и высокой эластичностью, с низкой иммуногенностью, т.к. конструкции на его основе разрушаются с образованием нетоксичных продуктов. Часть экспериментальных образцов модифицирована компонентами внеклеточного матрикса. В качестве такого агента выбран желатин, введение его в состав позволило повысить адгезию и пролиферацию культивируемых клеток. Экспериментальные образцы биорезорбируемым микроносителей были получены из трехмерных пористых матриксов на основе фиброина шелка. Данный метод был выбран в связи с тем, что он является наиболее доступным, дешёвым и позволяет получить микроносители с необходимыми характеристиками: сложная поверхность, имеющая большую площадь поверхности при линейных размерах от 50 до 300 мкм. Каждую наработку экспериментальных образцов выполняли в соответствие с Лабораторным регламентом получения нового биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток. Далее полученные экспериментальные образцы биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток были охарактеризованы в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний. В экспериментах in vitro исследованы адгезия, рост и жизнеспособность клеток разных типов, включая кератиноциты, макрофаги и фибробласты, на микроносителях. Исследования данных процессов выполнялись с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, позволяющей исследовать биологические объекты без нарушения их пространственной организации, а также наблюдать за живыми, нефиксированными, клетками. В связи с тем, что данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемых микроносителей, загруженных культивированными клетками человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, как при введении невитализированых микроносителей, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи, экспериментальные образцы разрабатываемого микроносителя также витализировались. Для этого была разработана методика витализации экспериментальных образцов. Для исследования экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток in vivo была использована модель полнослойной кожной раны мыши. Образцы микроносителей были введены интрадермально экспериментальным животным. Последующее исследование образцов с целью изучения острой токсичности, скорости заживления и полноты регенерации выполнялись с использованием классических гистологических методов, а также посредством анализа макрофотографии ран. Также был выполнен микроскопический и иммунохимический анализы. При проведении исследований был выполнен сравнительный анализ с целью определения влияния витализации экспериментальных образцов микроносителя аллогенными фибробластами, макрофагами и кератиноцитами на скорость заживления и регенерации в моделях полнослойных ран мыши. Исследование влияния последовательного внесения микроносителей с разными отельными типами клеток, участвующими в процессах регенерации, и внесения микроносителей, содержащими композиции клеток, участвующих в процессах регенерации, на скорость и полноту восстановления.

Результаты исследования

В результате выполнения проекта была составлена и утверждена следующая научно-техническая и конструкторская документация: с учетом требований ОСТ 64-02-003- 2002 был разработан Лабораторный регламент создания экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток (БМНДК). С учетом нормативных документов и на основании полученных результатов теоретических и предварительных экспериментальных изысканий был разработан «План исследований in vivo экспериментальных образцов БМНДК» и «Программа и методики испытаний экспериментальных образцов БМНДК in vitro», а также «Методика витализации экспериментальных образцов БМНДК». В соответствии с утвержденным регламентом были наработаны несколько партий экспериментальных образцов БМНДК, часть образцов была модифицирована введением в состав желатина. Для образцов были выполнены исследования деградации экспериментальных образцов. Анализ данных показал, что при продолжительной инкубации в нейтральной среде образцы БМНДК были стабильны, можно считать образцы БМНДК устойчивыми к деградации в окисляющей среде в течение 3 недель. Деградация материала предполагает также и биорезорбцию БМНДК в условиях выраженного клеточного ответа или при развитии воспалительных процессов. Результаты проведённых исследований показали, что: экспериментальные образцы БМНДК поддерживают эффективную адгезию клеток, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран; поверхность экспериментальных образцов БМНДК является прекрасным субстратом для пролиферации как иммортализованных, так и первичных клеточных культур, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран; экспериментальные образцы БМНДК обеспечивают жизнеспособность как иммортализованных, так и нормальных клеток, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран, в течение 7 дней. Введение невитализированных экспериментальных образцов БМНДК и витализированных кератиноцитами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК способствовало снижению скорости затягивания раны в первые дни, при этом инъекция экспериментальных образцов БМНДК, витализированных аллогенными фибробластами (МЭФ), не приводила к снижению контракции раны в первые дни. На третий день после нанесения полнослойной раны кожи разницы в площади раны в контрольной и экспериментальных группах не наблюдалось. На 7-ые сутки после нанесения травмы в контрольной и экспериментальных группах животных, получавших инъекции невитализированных и витализированных фибробластами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК, сохранялся струп, при этом площадь раны у животных, которым вводили витализированные микроносители, достоверно отличалась от площади ран у мышей из контрольной группы и животных, получавших инъекции невитализированных микроносителей. В то время как у животных, которым вводили экспериментальные образцы БМНДК, витализированные кератиноцитами, струп отсутствовал и наблюдалось полное заживление раны. Таким образом, было установлено, что витализация экспериментальных образцов БМНДК приводит к ускорению заживления полнослойной раны кожи мыши, при этом витализация микроносителей кератиноцитами ускоряет реэпителизацию раны. 

Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале использования разработанных микроносителей в терапевтической практике.

 

Практическая значимость исследования
Области применения: тканевая инженерия, регенеративная медицина, травматология, хирургия, косметология. Разработка и использование микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов имеет значительный потенциал, как в фундаментальном, так и прикладном значении. Микроносители могут быть использованы для решения задач клеточной биологии, например, воздействия ростовых факторов на дифференцировку стволовых клеток. Создание с их помощью адекватной трехмерной среды роста для многих клеток является важнейшим фактором нормального функционирования, что позволит изучать различные внутриклеточные процессы в состоянии, максимально приближенном к естественному. На основе микроносителей могут быть созданы модельные системы для исследования клеточной миграции, ангиогенеза, остеогенеза и других процессов. Кроме того, эта технология чрезвычайно перспективна в медицинском аспекте как основа для заполнения существенных кожных дефектов и ускорения регенерации кожных покровов, так и лечения повреждений различных типов тканей в условиях затрудненного к ним доступа. К ним относятся костная и хрящевая ткани, ткани печени, центральной нервной системы и др. С помощью гепатоцитов, культивированных на микроносителях возможно создание экстракорпорального биоискусственного устройства для пациентов с тяжелыми поражениями печени, ожидающими ее пересадки. Культивирование человеческих стволовых клеток на микроносителях позволяет сохранить их плюрипотентность и направлять их дифференцировку, что открывает широкие возможности их использования в области регенеративной медицины. Создаваемые биодеградируемые микроносители в виде суспензий могут использоваться и в качестве резервуаров для таргетной доставки лекарств при лечении широкого спектра заболеваний. Результаты проекта могут быть востребованы государственными и коммерческими организациями, деятельность которых связана с продвижением на рынок инновационных высокотехнологичных медицинских изделий и лекарственных препаратов. Потребителем разрабатываемых изделий медицинского назначения могут быть специализированные медицинские учреждения, деятельность которых связана с лечением заболеваний и повреждений различных органов