14.604.21.0148
Задачи: Разработка научных, методических и технологических основ для создания биорезорбируемого микроносителя, предназначенного для инъекций клеток разных типов в область заживления и регенерации ран, включая выбор оптимального состава микроносителя для обеспечения формирования на его поверхности условий для адгезии и роста клеток, ускоряющих заживление и регенерацию; выбор способа получения микроносителя, обеспечивающего возможность проведения инъекций в область регенерации; определение влияния витализации микроносителя различными типами клеток и их смесями на скорость заживления ран и восстановление структуры ткани в модели полнослойных ран экспериментальных животных.
Разработка микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов для решения задач тканевой инженерии и регенеративной медицины имеет значительный потенциал, как в фундаментальном, так и прикладном значении. Создаваемая микроносителями трехмерная среда роста для культивируемых клеток является важнейшим фактором их дальнейшего нормального функционирования после введения в область травмы или другого поражения. Повреждения кожи являются удобной моделью как для отработки методов введения биодеградируемых микроносителей, так и для изучения их влияния на скорость заживления и регенерации тканей. Микроносители – это частицы от 100 до 400 мкм в диаметре, которые изготавливаются из различных материалов и могут использоваться для прикрепления клеток и последующего введения в рану. В результате реализации проекта разработаны научно-технические основы для создания отечественного биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток, обеспечивающих ускорение репарационных процессов и процессов регенерации. В качестве основы для создания экспериментальных образцов микроносителя использован фиброин шелка - биополимер, обладающий впечатляющими механическими свойствами, в том числе высокой прочностью на разрыв и высокой эластичностью, с низкой иммуногенностью, т.к. конструкции на его основе разрушаются с образованием нетоксичных продуктов. Часть экспериментальных образцов модифицирована компонентами внеклеточного матрикса. В качестве такого агента выбран желатин, введение его в состав позволило повысить адгезию и пролиферацию культивируемых клеток. Экспериментальные образцы биорезорбируемым микроносителей были получены из трехмерных пористых матриксов на основе фиброина шелка. Данный метод был выбран в связи с тем, что он является наиболее доступным, дешёвым и позволяет получить микроносители с необходимыми характеристиками: сложная поверхность, имеющая большую площадь поверхности при линейных размерах от 50 до 300 мкм. Каждую наработку экспериментальных образцов выполняли в соответствие с Лабораторным регламентом получения нового биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток. Далее полученные экспериментальные образцы биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток были охарактеризованы в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний. В экспериментах in vitro исследованы адгезия, рост и жизнеспособность клеток разных типов, включая кератиноциты, макрофаги и фибробласты, на микроносителях. Исследования данных процессов выполнялись с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, позволяющей исследовать биологические объекты без нарушения их пространственной организации, а также наблюдать за живыми, нефиксированными, клетками. В связи с тем, что данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемых микроносителей, загруженных культивированными клетками человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, как при введении невитализированых микроносителей, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи, экспериментальные образцы разрабатываемого микроносителя также витализировались. Для этого была разработана методика витализации экспериментальных образцов. Для исследования экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток in vivo была использована модель полнослойной кожной раны мыши. Образцы микроносителей были введены интрадермально экспериментальным животным. Последующее исследование образцов с целью изучения острой токсичности, скорости заживления и полноты регенерации выполнялись с использованием классических гистологических методов, а также посредством анализа макрофотографии ран. Также был выполнен микроскопический и иммунохимический анализы. При проведении исследований был выполнен сравнительный анализ с целью определения влияния витализации экспериментальных образцов микроносителя аллогенными фибробластами, макрофагами и кератиноцитами на скорость заживления и регенерации в моделях полнослойных ран мыши. Исследование влияния последовательного внесения микроносителей с разными отельными типами клеток, участвующими в процессах регенерации, и внесения микроносителей, содержащими композиции клеток, участвующих в процессах регенерации, на скорость и полноту восстановления.
В результате выполнения проекта была составлена и утверждена следующая научно-техническая и конструкторская документация: с учетом требований ОСТ 64-02-003- 2002 был разработан Лабораторный регламент создания экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток (БМНДК). С учетом нормативных документов и на основании полученных результатов теоретических и предварительных экспериментальных изысканий был разработан «План исследований in vivo экспериментальных образцов БМНДК» и «Программа и методики испытаний экспериментальных образцов БМНДК in vitro», а также «Методика витализации экспериментальных образцов БМНДК». В соответствии с утвержденным регламентом были наработаны несколько партий экспериментальных образцов БМНДК, часть образцов была модифицирована введением в состав желатина. Для образцов были выполнены исследования деградации экспериментальных образцов. Анализ данных показал, что при продолжительной инкубации в нейтральной среде образцы БМНДК были стабильны, можно считать образцы БМНДК устойчивыми к деградации в окисляющей среде в течение 3 недель. Деградация материала предполагает также и биорезорбцию БМНДК в условиях выраженного клеточного ответа или при развитии воспалительных процессов. Результаты проведённых исследований показали, что: экспериментальные образцы БМНДК поддерживают эффективную адгезию клеток, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран; поверхность экспериментальных образцов БМНДК является прекрасным субстратом для пролиферации как иммортализованных, так и первичных клеточных культур, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран; экспериментальные образцы БМНДК обеспечивают жизнеспособность как иммортализованных, так и нормальных клеток, вовлечённых в процессы заживления и регенерации ран, в течение 7 дней. Введение невитализированных экспериментальных образцов БМНДК и витализированных кератиноцитами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК способствовало снижению скорости затягивания раны в первые дни, при этом инъекция экспериментальных образцов БМНДК, витализированных аллогенными фибробластами (МЭФ), не приводила к снижению контракции раны в первые дни. На третий день после нанесения полнослойной раны кожи разницы в площади раны в контрольной и экспериментальных группах не наблюдалось. На 7-ые сутки после нанесения травмы в контрольной и экспериментальных группах животных, получавших инъекции невитализированных и витализированных фибробластами и макрофагами экспериментальных образцов БМНДК, сохранялся струп, при этом площадь раны у животных, которым вводили витализированные микроносители, достоверно отличалась от площади ран у мышей из контрольной группы и животных, получавших инъекции невитализированных микроносителей. В то время как у животных, которым вводили экспериментальные образцы БМНДК, витализированные кератиноцитами, струп отсутствовал и наблюдалось полное заживление раны. Таким образом, было установлено, что витализация экспериментальных образцов БМНДК приводит к ускорению заживления полнослойной раны кожи мыши, при этом витализация микроносителей кератиноцитами ускоряет реэпителизацию раны.
Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале использования разработанных микроносителей в терапевтической практике.