Регистрация / Вход
Прислать материал

Методы оценки принадлежности лекарственных препаратов к ингибиторам и индукторам белка-транспортера гликопротеина-Р

ФИО
Щулькин Алексей Владимирович
Surname Name
Shchulkin Aleksey
Организация
кафедра фармакологии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России
Область наук
Науки о жизни и медицина
Название доклада
Методы оценки принадлежности лекарственных препаратов к ингибиторам и индукторам белка-транспортера гликопротеина-Р
Project title
Methods for evaluating drugs belonging to protein-transporter P-glycoprotein inhibitors and inducers
Резюме
В работе представлены подходы к оценке принадлежности лекарственных препаратов к индукторам и ингибиторам белка-транспортера гликопротеина-Р в опытах in vitro и in vivo. Обосновывается необходимость проведения доклинических исследований in vivo. Описан дизайн и статистическая обработка исследований in vivo.
Ключевые слова
гликопротеин-Р, ABCB1-белок, межлекарственные взаимодействия
Тезисы

Гликопротеин-Р (ABCB1, MDR1, Pgp) – АТФ-зависимый белок-транспортер (АВСВ1), относящийся к суперсемейству ABC-транспортеров (ATР-binding cassette) и участвующий в транспорте липофильных эндогенных и экзогенных субстратов из клетки [Якушева Е.Н. и др., 2014]. Показано, что данный белок-транспортер локализуется на поверхности гепатоцитов, обращенной к желчным протокам, на апикальной мембране энтероцитов, на апикальной поверхности эпителиоцитов проксимальных почечных канальцев, в эндотелиоцитах гистогематических барьеров [Якушева Е.Н. и др., 2014]. Поэтому считается, что Pgp играет важную роль в фармакокинетике лекарственных препаратов, являющихся его субстратами.

Воздействие ряда лекарственных веществ может модулировать активность белка-транспортера. Ингибиторы Рgp снижают его функциональную активность, что в ряде случаев ассоциировано с развитием нежелательных лекарственных реакций. Индукторы, напротив, повышают активность белка-транспортера, что способствует снижению эффективности проводимой фармакотерапии. Поэтому все новые лекарственные препараты в США подвергаются тестированию на принадлежность к субстратам и ингибиторам Рgp (U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration и Center for Drug Evaluation and Research) [FDA].

Согласно данным рекомендациям, первоначально исследования проводятся на культурах клеток. При оценке влияния изучаемого лекарственного препарата на активность Pgp его добавляют к культуре клеток Caco-2 в возрастающих концентрациях и оценивают эффлюкс (выведение) данными клетками маркерных субстратов белка-транспортера (на клетках чаще всего используют родамин). Если эффлюкс родамина (или другого субстрата) понижается с повышением концентрации изучаемого препарата, то делают заключение, что изучаемое вещество является ингибитором Pgp [FDA].

При изучении принадлежности лекарственных препаратов к субстратам Pgp первоначально на клетках, гиперэкспрессирующих данный белок-транспортер (например, Caco-2), оценивают транспорт данных препаратов через цитоплазматическую мембрану, а затем добавляют ингибитор белка-транспортера и фиксируют степень ингибирования трансмембранного переноса. Если эффлюкс снижается более чем на 50%, то делают вывод о том, что лекарственный препарат относится к субстратам Pgp.

Если в опытах in vitro устанавливают, что новый лекарственный препарат является субстратом или ингибитором белка-транспортера, то в дальнейшем его изучают in vivo. Если в опытах in vitro устанавливают, что новый лекарственный препарат не является субстратом или ингибитором белка-транспортера, то, согласно рекомендациям FDA, в дальнейших исследованиях in vivo нет необходимости.

В отличие от данных рекомендаций, на наш взгляд, при тестировании влияния лекарственных препаратов на активность Pgp в любом случае необходимо проводить исследования in vivo на доклиническом этапе, даже при отрицательном результате (отсутствие влияния на активность Pgp) в опытах in vitro. Это обусловлено тем, что ряд лекарственных препаратов может оказать влияние на гормональный фон или метаболические процессы, а это, в свою очередь, может повлиять на активность Pgp. Таким образом, влияние на белок транспортер будет опосредованным, что нельзя выявить в исследованиях iv vitro.

В качестве биологических моделей для оценки влияния лекарственных препаратов на активность Pgp in vivo могут быть использованы мыши, крысы и кролики. Однако, наибольшая гомология между аминокислотными последовательностями белка-транспортера наблюдается у человека и кролика.

Исследования in vivo по оценке влияния лекарственных препаратов на функциональную активность Pgp заключаются в определении изменений фармакокинетики маркерного субстрата Pgp на фоне введения изучаемых веществ. Если наблюдается накопление маркерного субстрата и замедление его выведения, это свидетельствует о том, что тестируемое вещество является ингибитором данного белка-транспортера. Если же отмечается снижение содержания маркерного субстрата в организме и ускорение его выведения, это свидетельствует об индукции Pgp.

Маркерный субстрат для оценки функционирования Рgp – это вещество экзогенного или эндогенного происхождения (ксенобиотик, эндобиотик) фармакокинетика которого зависит исключительно (или в большей степени) от функционирования данного белка-транспортера, то есть он не подвергается биотрансформации и не является субстратом других белков-транспортеров.

Согласно рекомендациям FDA, в качестве маркерного субстрата для оценки влияния изучаемого препарата на активность Pgp могут быть использованы: дигоксин, дабигатрана этексилат, фексофенадин, талинолол и ряд других препаратов [FDA].

Исследования оценки влияния лекарственных препаратов на функциональную активность Pgp in vivo могут иметь один из следующих дизайнов:

  1. параллельное исследование;
  2. повторное исследование;
  3. перекрестное исследование.

При параллельном исследовании формируются две группы добровольцев или лабораторных животных: первая группа – получающие маркерный субстрат (S) после курсового введения плацебо (вода для инъекций, дистиллированная вода, физиологический раствор), вторая группа – испытуемые, получающие маркерный субстрат после курсового введения изучаемого препарата (P+S). Изучаемый препарат вводят per os в максимальной терапевтической дозе курсом 10–14 дней. Последняя доза изучаемого препарата вводится утром непосредственно перед введением маркерного субстрата, чтобы можно было оценить непосредственное взаимодействие изучаемого вещества и маркерного субстрата Pgp. При этом сравниваются фармакокинетические параметры маркерного субстрата у первой и второй групп.

При повторном дизайне исследования проводятся на одной группе испытуемых. Первоначально у добровольцев (животных) определяют фармакокинетику маркерного субстрата Pgp, затем в течение 10–14 дней вводят изучаемый препарат и повторно определяют фармакокинетику маркерного субстрата белка-транспортера. Сравниваются фармакокинетические параметры маркерного субстрата до и после введения изучаемого препарата.

Перекрестный дизайн является наиболее предпочтительным при проведении клинических исследований по изучению влияния лекарственных препаратов на функциональную активность Pgp [FDA]. Для веществ с вариабельной фармакокинетикой рекомендуется увеличивать число перекрестов.

При одном перекресте дизайн исследования выглядит следующим образом. Первой группе испытуемых вводят маркерный субстрат Pgp (S) после курсового введения плацебо (вода для инъекций, дистиллированная вода, физиологический раствор), а второй группе – маркерный субстрат после курсового введения изучаемого препарата (P+S). Далее следует отмывочный период, достаточный для снижения концентрации маркерного субстрата ниже порога биоаналитического определения и для восстановления измененной активности Pgp на фоне введения изучаемого вещества у второй группы. По нашим данным продолжительность отмывочного периода должна быть не менее 14 дней. После отмывочного периода первой группе испытуемых вводят маркерный субстрат после курсового введения изучаемого вещества (P+S), а второй группе – маркерный субстрат Pgp после курсового введения плацебо (S).

Для оценки фармакокинетики маркерного субстрата рассчитывают следующие фармакокинетические параметры модельнонезависимым методом: 

Сmax – максимальная концентрация изучаемого вещества;

Тmax – время достижения максимальной концентрации;

AUC0-t – площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время, где t – выбранная временная точка, обычно время последнего забора крови.

Дополнительно также целесообразно рассчитывать общий клиренс, период полувыведения и коэффициенты абсорбции (Сmax/AUC0-t, AUC0-t/T1/2), которые позволят установить, где именно изменилась активность Pgp (органы выведения или кишечник), т.е. органоспецифичность действия тестируемого лекарственного средства.

Согласно американским и европейским рекомендациям по изучению межлекарственных взаимодействий in vivo значимость взаимодействия оценивают, используя 90-процентный доверительный интервал отношения геометрических средних фармакокинетических параметров маркерного субстрата при совместном введении с изучаемым веществом к геометрическим средним фармакокинетических параметров субстрата при его изолированном применении [FDA]. Клинически значимым считается взаимодействие лекарственных препаратов если 90%-й доверительный интервал изменения фармакокинетических параметров маркерного субстрата не укладывается в диапазон 80–125% (0,8-1,25).

Для расчета доверительных интервалов полученные фармакокинетические параметры логарифмируют, а далее подвергают дисперсионному анализу. При параллельном исследовании – однофакторному дисперсионному анализу, при повторном исследовании – дисперсионному анализу повторных измерений, при перекрестном исследовании – многофакторному дисперсионному анализу, включающему такие факторы, как группа, субъект внутри группы, период и лекарственный препарат. На основе дисперсионного анализа строят доверительные интервалы (в логарифмической шкале) для оценки различия между сравниваемыми препаратами. Затем полученные доверительные интервалы подвергаются обратному преобразованию (рассчитывают экспоненту), чтобы построить желаемые доверительные интервалы для отношения средних в исходных (не преобразованных) единицах измерения. При оценке статистической значимости изменения Тмакс доверительные интервалы не рассчитывают, а применяют методы непараметрической статистики. При параллельном дизайне – критерий Манна-Уитни, при последовательном и перекрестном дизайне – Вилкоксона.

Работа поддержана грантом РФФИ №6-04-00320 а 

Summary of the project
In the work approaches to assessing drugs belonging to protein-transporter P-glycoprotein inducers and inhibitors in experiments in vitro and in vivo are presented. The necessity of carrying out pre-clinical studies in vivo is proved. The design and statistical processing of the researches in vivo is described.
Keywords
P-glycoprotein, ABCB1-protein, drug-drug interactions