Регистрация / Вход
Прислать материал

ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФИТАЗЫ PANTOEAE AGGLOMERANS КАК СПОСОБ РЕШЕНИЯ НЕДОСТАТКА ФОСФОРА В ПИТАНИИ РАСТЕНИЙ

Сведения об участнике
ФИО
Валеева Лия Рашитовна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Агро-, био- и производственные технологии
Раздел области наук
Земледелие и растениеводство
Тема
ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФИТАЗЫ PANTOEAE AGGLOMERANS КАК СПОСОБ РЕШЕНИЯ НЕДОСТАТКА ФОСФОРА В ПИТАНИИ РАСТЕНИЙ
Резюме
Использование бактериальных фитаз представляет огромный интерес в качестве пути решения проблемы недостатка фосфора. Нами получены гомозиготные линии растений A. thaliana с интегрированным геном фитазы P. agglomerans. Ген фитазы экспрессируется растениями на транскрипционном и трансляционном уровне. Полученные растения способны расти на среде с фитатом в качестве единственного источника фосфора. Фитазная активность модифицированных растений выше в 2.5 раз (Р<0.05), чем у растений дикого типа. При росте на среде с фитатом сухая масса побегов и корней, общее содержание фосфора в тканях модифицированных растений выше (Р<0.05), чем у контрольных растений.
Ключевые слова
фосфорный дефицит, фитаза, гетерологичная экспрессия
Цели и задачи
Цель работы – получение модифицированных растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующих рекомбинантную бактериальную фитазу Pantoea agglomerans.
В работе решались следующие задачи:
1) Получить растения Arabidopsis thaliana, гомозиготные по интегрированному гену бактериальной фитазы Pantoea agglomerans.
2) Подтвердить экспрессию бактериальной фитазы в растениях на уровне транскрипции гена и трансляции белка.
3) Определить фитазную активность в тканях модифицированных растений.
4) Изучить влияние экспрессии бактериальной фитазы на рост и развитие растений.
5) Определить содержание фосфора в тканях растений при росте на средах с разными источниками фосфора.
Введение

Фосфор играет ключевую роль во многих процессах, протекающих в живых организмах. Тогда как доступных форм фосфора в почве становится все меньше, растет содержание труднодоступных соединений - фитатов. Решение проблемы фосфорного дефицита становится все более актуальным и требует новых и эффективных подходов.

Растения и животные не могут усваивать фитат, но многие микроорганизмы способны к его расщеплению за счет действия фитаз. Использование фитаз представляет интерес в качестве пути решения проблемы недостатка фосфора. Перспективным направлением является создание модифицированных растений, синтезирующих бактериальные фитазы и способных усваивать фосфор из фитата.

Методы и материалы

Ген бактериальной фитазы P. agglomerans оптимизировали с помощью программы Codon Adaptation Tool. Клонирование проводили по стандартным методикам. Использовали методы ПЦР, рестрикции, лигирования, химической трансформации бактерий и электропорации.

Ген фитазы модифицировали путем добавления последовательности сигнального пептида гена экстенсина моркови и последовательности His-Tag.

Растения Arabidopsis thaliana дикого типа (экотип Columbia) выращивали в климатической камере с условиями роста: фотопериод 16 ч. день/ 8 ч. ночь, 20 ºС, влажность 65%. Для трансформации использовали цветущие растения дикого типа в возрасте 1 месяца.

Агробактериальную трансформацию растений проводили методом макания цветков растений в суспензию агробактерий.

Для селекции растений семена высевали стерильно на чашки Петри с использованием среды MS с добавлением гербицида BASTA.

Генотипирование полученных растений проводили методом ПЦР.

Экспрессию рекомбиантной фитазы в растениях на уровне транскрипции определяли методом ОТ-ПЦ, на уровне трансляции белка - методом иммуноблотинга.
Для подтверждения способности модифицированных растений усваивать фитат растения выращивали на жидкой минеральной среде с добавлением фитата в качестве единственного источника фосфора.

Фитазную активность растений определяли по методу Jog et al., 2005.

Измерение сухой массы растений проводили по методу Richardson et al., 2001. Измерение содержания фосфора в тканях растений проводили по ГОСТ 26657-97.

Описание и обсуждение результатов

1. Создана гетерологичная система с геном бактериальной фитазы для экспрессии в растениях.

Последовательность бактериального гена фитазы предварительно кодон-оптимизировали для дальнейшей экспрессии в клетках растений.

Оптимизированный ген модифицировали путем добавления с 5’-конца последовательности сигнального пептида гена экстенсина моркови; с 3’-конца гена фитазы была добавлена последовательность His-Tag.

Далее проводили клонирование полученной последовательности в бинарный вектор pCBK05, в Т-ДНК области которого содержатся ген устойчивости к гербициду BASTA и конститутивный вирусный промотор мозаики цветной капусты CaMV35S.

Методом электропорации получен штамма Agrobacterium tumefaciens GV031 с интегрированным рекомбинантным вектором с геном фитазы.

2. Получены гомозиготные по гену фитазы линии растений A. thaliana.

Была проведена агробактериальная трансформация растений. Далее проводили селекцию модифицированных растений на среде с гербицидом. Полученные трансгенные растения пересаживали из стерильных чашек Петри на почву в отдельные горшочки.

С использованием вектора pCEV04 на основе вирусного промотора CaMV35S, содержащего модифицированный ген фитазы paPhyC P. agglomerans, получили 3 независимые линии (Е1, E2, E3 линии) растений Т1. Гомозиготные линии растений по гену фитазы получены в 3 и 5 поколении. Наличие трансгенной вставки подтверждено генотипированием.

3. Экспрессия гена бактериальной фитазы в растениях подтверждена на уровне транскрипции мРНК и трансляции белка.

Анализировали тотальную мРНК растений на наличие транскриптов последовательности гена фитазы методом ОТ-ПЦР: получали кДНК растений и проводили ПЦР на кДНК со специфическими к гену фитазы праймерами. Для растений с геном фитазы под управлением промотора CaMV35S получены ПЦР-продукты с кДНК; геномная ДНК в пробах не присутствует.

Проводили анализ экспрессии бактериальной фитазы PaPhyC на уровне трансляции белка. Показано, что растения синтезируют бактериальную модифицированную фитазу молекулярной массы 55 кДа, локализованную в клеточной стенке растений, что связано с наличием сигнального пептида в структуре модифицированной конструкции гена фитазы.

4. В клеточной стенке клеток модифицированных растений определена фитазная активность.

Способность модифицированных растений расти и усваивать фосфор из среды при росте на среде с фитатом обусловлена синтезом активной рекомбинантной бактериальной фитазы PaPhyC.

5. Выращенные на среде с фитатом модифицированные растения имеют большую сухую массу и большие линейные размеры по сравнению с растениями дикого типа и контрольной линии растений, не экспрессирующей фитазу.

6. В тканях модифицированных растений содержание фосфора значительно выше выше, чем в тканях растений дикого типа при росте на среде с фитатом.

Используемые источники
1. R. Greiner / Protein J.2004. V.23. P. 567–576.
2. E.Angov / Biotechnology Journal. 2011.V.6.Р. 650-659.
3. S. Camiolo, L. Farina, A. Porceddu / Genetics J. – 2012. Vol. 192, P. 641–649.
4. Y-Y. Yau, N. Stewart / BMC Biotechnology. – 2013. V. 13:36. P. 1-23.
5. A. Bińka, W. Orczyk, A. Nadolska-Orczyk / J. Appl. Genetics. – 2012. – V. 53. – P. 1–8.
6. Бернард Р. Глик, Джек Дж. Пастернак. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение : [пер. с англ] М. : Мир, 2002.С. 374 – 377.
7. С.Н. Щелкунов, Генетическая инженерия : учеб.-справ. пособие. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496с. – ISBN 5-94087-098-8.
8. J. Clough, A. F. Bent / The Plant Journal 1998. V.16(6).P. 735-743.
9. P. Tocquin, L. Corbesier, A. Havelange, A. Pieltain, E. Kurtem, G. Bernier, C. Périlleux / BMS Plant biology. 2003. V.3. P. 1 – 10.







Information about the project
Surname Name
Valeeva Liya
Project title
Heterologous expression of bacterial phytase in plants as the coping of phosphorus deficiency
Summary of the project
We report construction of an efficient gene expression system in plants A. thaliana expressing a bacterial phytase gene from Pantoea sp. Phytase gene expression is controlled by a strong 35S constitutive promoter. Homozygous lines of transgenic plants were obtained. Expression of recombinant phytase mRNA in plant tissue was confirmed by RT-PCR, phytase protein expression was confirmed by Western blotting. We shown that transgenic plants had phytase activity/ Drt weights of shoots and roots and phosphorus content in ntansgenic plants tissues are significantly higher (P<0.05) than in control WT plants. Therefore modified plants can grow in the medium with phytate as the source of phosphorus.

Keywords
phosphorus deficiency, phytase, heterologous expression