Везикулообразование как механизм защиты Yersinia pseudotuberculosis от специфического бактериофага

Исследованы механизмы начальной стадии взаимодействия бактерий Yersinia pseudotuberculosis со специфическим бактериофагом. Установлено, что добавление псевдотуберкулезного бактериофага к культуре Y. pseudotuberculosis индуцирует рост везикулообразующей способности бактерий и изменяет их морфологические свойства. Высказано предположение о том, что повышение везикулообразования является антистрессорной реакцией возбудителя псевдотуберкулеза на присутствие специфического бактериофага.

Цель: охарактеризовать начальную стадию взаимодействия клеток Y. pseudotuberculosis со специфическим бактериофагом.
Задачи:
1) выявить способность псевдотуберкулезного бактериофага влиять на везикулообразование Y. pseudotuberculosis;
2) оценить влияние псевдотуберкулезного бактериофага на морфометрические показатели клеток Y. pseudotuberculosis;
3) определить колониеобразующую активность бактерий и бляшкообразующую активность бактериофага в условиях совместной инкубации.

Актуальной проблемой современной инфекционной медицины является приобретение патогенными бактериями, в том числе рода Yersinia, антибиотикорезистентности, что вынуждает осуществлять поиск альтернативных способов борьбы с бактериальными инфекциями [1, 2]. В связи с этим возобновляется интерес к возможности применения в этих целях бактериофагов. Разработка лечебно-профилактических препаратов на основе иерсиниозных бактериофагов предполагает проведение исследований, направленных на изучение механизмов взаимодействия фаговых частиц с микробной клеткой.

В работе использовали бактерии Y. pseudotuberculosis, штамм 1b (кат. №474) и бактериофаг диагностический псевдотуберкулезный, полученные из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Бактериальную культуру выращивали в течение 1 суток при температуре 37°С на плотной питательной среде на основе питательного агара «Биотехновация» (БТН-агар, Россия). В качестве разводящей жидкости использовали буферный раствор SM. 

Инкубацию микробных клеток и бактериофага (в конечной концентрации ~ 0,9∙10⁹ м.к./мл и ~ 1,0∙10⁹ частиц/мл соответственно) проводили при температуре 37ºС в течение 20 минут. Концентрацию жизнеспособных бактерий определяли чашечным методом. Титр фаговых частиц определяли по методу Грациа [3].

Фиксированные  глутаровым альдегидом (2,5 %) опытные и контрольные образцы негативно контрастировали 2 % уранилацетатом. Снимки получали на электронном микроскопе JEM-2100 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 160 кВ.

После 20 минут совместной инкубации  с бактериофагом отмечено существенное  увеличение количества микробных клеток, продуцирующих везикулы (таблица). Это может служить подтверждением данных, полученных на других микроорганизмах, о защитной функции везикулообразования у грамотрицательных микробов в отношении специфических бактериофагов [4].

Таблица. Влияние специфического бактериофага на везикулообразование клеток Y. pseudotuberculosis после 20 минут совместной инкубации

Исследуемый образец	Доля клеток с везикулами, %	Общее количество просмотренных клеток
Клетки с фагом	71,6 ± 1,4	1043
Клетки без фага (контроль)	33,8 ± 1,4	1075

Совместная инкубация бактериофага и клеточной культуры в течение 20 минут приводили к изменению морфологии клеток. Наблюдался, неровный, рваный, фрагментарный слой матрикса на поверхности клеток, включающий частицы бактериофага и везикулы (рисунок). Цитоплазма смещалась от полюсов к центру клетки.  Длина клеток уменьшалась с 1,23±0,06 (контроль) до 1,03±0,06 мкм (клетки с фагом).

Совместная инкубация в течение 20 минут клеток Y. pseudotuberculosis и псевдотуберкулезного бактериофага приводила к уменьшению числа жизнеспособных микробов в сравнении с контролем (~ в 7 раз), что может объясняться лизисом клеток под действием фага и/или неспособностью пролиферировать клеток, к наружной мембране которых прикреплены частицы фага. При этом титр бактериофага также уменьшился (~ в 2,6 раз). Это может быть связано с возможным взаимодействием фага с везикулами или микробными клетками (согласно методике Грациа, высев производится из надосадочной жидкости после низкоскоростного центрифугирования, поэтому прикрепленные фаговые частицы осаждались вместе с клетками). 

Рисунок. Электронно-микроскопическое изображение клеток Y. pseudotuberculosis после взаимодействия со специфическим бактериофагом. Стрелки 1 – частицы бактериофага, стрелки 2 – везикулы

Выводы

1. Совместная инкубация (37°С, 20 мин) клеток Y. pseudotuberculosis со специфическим бактериофагом приводит к повышению доли везикулообразующих клеток с 33,8 до 71,6 %.

2. Добавление псевдотуберкулезного бактериофага к культуре Y. pseudotuberculosis вызывает изменение морфологии клеток и уменьшение их размеров.

3. Через 20 минут совместной инкубации наблюдается снижение концентраций бактерий Y. pseudotuberculosis и псевдотуберкулезного бактериофага.

1. Информационный бюллетень №12 Всемирной Организации Здравоохранения: сдерживание развития устойчивости к противомикробным препаратам. – Выпуск №88. – 2010. – С. 877–953.
2. Welch T.J. Multiple antimicrobial resistance in plague: an emerging public health risk / T.J. Welch, W.F. Fricke, P.F. McDermott et al. // PLoS One. – 2007. – Vol. 2. – №3, E309.
3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская. – М.: Медицина, 1978. – С. 77–79.
4. Manning A. J. Contribution of bacterial outer membrane vesicles to innate bacterial defense / A. J. Manning, M. J. Kuehn // BMC Microbiology. – 2011. – Vol. 258. – №11.

A mechanism of the initial stage of interaction between Yersinia pseudotuberculosis bacteria and specific bacteriophage have been assessed. It was found that the addition of phage to the Y. pseudotuberculosis culture induces bacterial vesicle-forming increase and alter their morphological properties. It is suggested that the vesicle-forming increasing is antistress reaction of Y. pseudotuberculosis in the presence of specific bacteriophage.