Регистрация / Вход
Прислать материал

Изучение ядерной функции каспаз при индукции генотоксического стресса

Сведения об участнике
ФИО
Прохорова Евгения Александровна
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Изучение ядерной функции каспаз при индукции генотоксического стресса
Резюме
В литературе показано, что в ответ на запуск апоптоза – типа программируемой клеточной гибели, может происходить перемещение его ключевых участников – каспаз, из цитоплазмы в ядро клетки. Однако накопленные данные противоречивы, и механизмы, лежащие в основе данного явления, как и ядерные функции каспаз остаются неясны. С целью их исследования разработан принципиально новый метод субклеточного фракционирования, применение которого продемонстрировало раннюю транслокацию активных форм каспаз-2, -3, -8 и -9 в ядра апоптотических клеток. Таким образом, установлен новый механизм амплификации апоптоза посредством ядерной транслокации и функции инициаторных и эффекторных каспаз.
Ключевые слова
Апоптоз, каспаза, ядро, повреждение ДНК
Цели и задачи
Проанализировать изменение внутриклеточного распределения каспаз при запуске апоптоза, исследовать опосредующие его механизмы и изучить ядерные функции, выполняемые каспазами в ходе апоптотической гибели.
Введение

Апоптоз – тип программируемой клеточной гибели, необходимый для нормального развития и функционирования организма. Ключевая роль в запуске и протекании апоптоза принадлежит каспазам, цистеиновым протеазам. В норме каспазы – цитоплазматические белки, однако в ответ на ряд апоптотических стимулов была отмечена их транслокация в ядро клетки. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе данного явления, и функции, впоследствии выполняемые каспазами, остаются неизвестны. Их исследование представляет важную фундаментальную задачу, решение которой может послужить основой для разработки новых методов лечения опухолевых и нервнодегенеративных заболеваний, развитие которых часто обусловлено нарушением активации апоптоза.

Методы и материалы

Работа выполнена на клеточных линиях человека HeLa (аденокарцинома шейки матки), Caov-4 (аденокарцинома яичника) и Caov-4 с2-/- (нокаутная по каспазе-2 клеточная линия Caov-4, полученная с использованием системы CRISPR/Cas9). Запуск апоптоза осуществлялся добавлением химиотерапевтического ДНК-повреждающего агента цисплатина (35 мкМ).

Для разделения цитоплазматической и ядерной фракций клетки инкубировались в гипотоническом буфере, лизировались 0,1% NP-40 (Nonidet P-40) и центрифугировались. Осадок ресуспендировался в изотоническом буфере с NP-40 (0,3%). После центрифугирования выделенные ядра промывались PBS и использовались для проведения электрофореза в ПААГ и последующего иммуноблоттинга или для измерения активности каспаз. Регистрация хемилюминесценции проводилась на приборе ChemiDocTM XRS+System (Bio-Rad). Измерение активности каспаз проводилось добавлением каспазных субстратов и регистрацией флуоресцентного сигнала с помощью Varioskan™ Flash Multimode Reader (Thermo Scientific).

Чистота получаемых фракций оценивалась DIC и флуоресцентной микроскопией на микроскопе DMI6000B (Leica) и анализом распределения маркеров клеточных компартментов методом иммуноблоттинга.

Препараты для конфокальной микроскопии готовились посредством трансфекции клеток каспаза-2-GFP конструктом или последовательной инкубации клеток с первичными и вторичными (Alexa-конъюгированными) антителами. Препараты анализировались с помощью микроскопа LSM 780 (Zeiss).

Описание и обсуждение результатов

Для анализа изменения локализации каспаз в ходе апоптоза разработан протокол субклеточного фракционирования, для чего проведено сравнение ряда широко используемых в литературе методов. Чистота получаемых фракций оценивалась микроскопией и иммуноблоттинг-анализом распределения белков-маркеров различных клеточных компартментов. В качестве подхода, обеспечивающего наиболее эффективное и быстрое разделение цитоплазмы и ядер клеток, выделен лизис неионным детергентом NP-40. Дополнительно подобраны концентрации NP-40 и времена инкубации с ним. Так, разработан протокол, позволяющий надежное выделение цитоплазматической и ядерной фракций, не содержащих компонентов других клеточных компартментов. Принимая во внимание значительные различия морфологии клеток HeLa и Caov-4, подобранные условия, вероятно, подходят для фракционирования большинства адгезивных клеточных линий млекопитающих.

Разработанный протокол фракционирования в комбинации с методами иммуноблоттинга и измерения активности каспаз был применен для изучения изменения локализации каспаз-2, -3, -8 и -9 в ходе цисплатин-индуцированной апоптотической гибели. Оценивались события, происходящие в первые 24 часа после ее запуска – до накопления фрагментированных и уже погибших клеток (согласно данным предварительного микроскопического анализа). В то время как в нестимулированных клетках наблюдалась преимущественно цитоплазматическая локализация каспаз, цисплатин-опосредованный запуск апоптоза приводил к ранней транслокации их проформ и каталитически активных фрагментов в ядра клеток до разрушения ядерной ламины и ядерной фрагментации. Так, перераспределение каспаз предшествовало значительному уменьшению их проформ, полноразмерных форм ПАРП и ламина В (ядерных субстратов каспаз), а также появлению расщепленных фрагментов данного ламина.

Дополнительное подтверждение транслокации каспаз в ядра апоптотических клеток получено оценкой изменения распределения одной из инициаторных каспаз, каспазы-2, методом конфокальной микроскопии (с использованием конструкта каспазы-2-GFP и иммунофлуоресценцией).

В то время как наблюдаемая ядерная транслокация прокаспаз в ходе апоптоза предполагает возможность активации каспаз непосредственно в ядрах, перемещение их активных форм свидетельствует о выполнении каспазами протеолитической функции в ядрах апоптотических клеток. 

В целом, детекция каталитически активных форм инициаторных (каспазы-2, -8, -9) и эффекторных (каспаза-3) каспаз в ядрах апоптотических клеток предполагает важность ядерной транслокации и функции не только эффекторных, но и инициаторных каспаз в процессе гибели клетки по пути апоптоза. Так, инициаторные каспазы могут осуществлять расщепление ряда специфичных ядерных субстратов и ускорять протеолиз субстратов эффекторных каспаз, опосредуя их активацию в ядрах апоптотических клеток.

Используемые источники
1) Prokhorova, E.A., et al. (2015). Role of the nucleus in apoptosis: Signaling and execution. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4593–4612.
2) Ferrando-May, E. (2005). Nucleocytoplasmic transport in apoptosis. Cell Death Differ. 12, 1263–1276.
3) Grote, P., et al. (2007). Commuting (to) suicide: An update on nucleocytoplasmic transport in apoptosis. Arch. Biochem. Biophys. 462, 156–161.
4) Zhivotovsky, B., et al. (1999). Caspases : their intracellular localization and translocation during apoptosis. Cell Death Differ. 6, 644–651.
5) Galluzzi, L., et al. (2014). Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future. Cell Death Dis. 5, e1257.
6) Julien, O., et al. (2016). Quantitative MS-based enzymology of caspases reveals distinct protein substrate specificities, hierarchies, and cellular roles. Proc. Natl. Acad. Sci. Mar 22. pii: 201524900.
Information about the project
Surname Name
Prokhorova
Project title
Assessment of the nuclear function of caspases following genotoxic stress
Summary of the project
Upon the induction of apoptosis, a type of programmed cell death, the translocation of caspases, its key players, from the cytoplasm to the nucleus was reported. Yet, the accumulated results are contradictory, and the mechanisms underlining the event, as well as the nuclear functions of caspases, remain elusive. To address these questions, an essentially new fractionation protocol was developed. Using this protocol, the early translocation of active caspase-2, -3, -8 and -9 to the nuclei of apoptotic cells was observed. Thus, a novel mechanism of apoptosis amplification via the nuclear translocation and function of both initiator and executioner caspases was revealed.
Keywords
Apoptosis, caspase, nucleus, DNA damage