Регистрация / Вход
Прислать материал

Анализ способности нитрифицирующих микроорганизмов к образованию биопленок

Сведения об участнике
ФИО
Рахманкулова Зиля Шаукатовна
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский национальный исследовательский технологический университет"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о Земле, экология и рациональное природопользование
Раздел области наук
Экология
Тема
Анализ способности нитрифицирующих микроорганизмов к образованию биопленок
Резюме
Путем многократного пересева микробного сообщества на селективные питательные среды были получены накопительные культуры нитрификаторов. Методом флуоресцентной in situ гибридизации была проведена идентификация микроорганизмов в составе выделенных накопительных культур нитрифицирующих микроорганизмов. С помощью модифицированного планшетного метода оценена способность нитрифицирующих микроорганизмов I фазы, II фазы, а также смешанной культуры (I и II фазы) образовывать биопленки.
Ключевые слова
нитрифицирующие микроорганизмы, нитрифицирующая биопленка, образование биопленки, флуоресцентная in situ гибридизация
Цели и задачи
Цель данной работы заключается в оценке способности образования биопленок нитрифицирующими микроорганизмами.
Задачами исследования являлись: получение накопительной культуры нитрифицирующих микроорганизмов активного ила; идентификация выделенных бактерий по морфологическим особенностям; идентификация выделенных бактерий методом флуоресцентной in situ гибридизации; оценка способности образования биопленок накопительными культурами аммонийокисляющих и нитритокисляющих микроорганизмов.
Введение

Процесс нитрификации в практике очистки сточных вод играет важную роль, так как является конечной стадией окислительных процессов, происходящих в системах биологической очистки. Кроме того, нитрификация лимитирует эти процессы, поскольку протекает медленно вследствие физиологических особенностей нитрифицирующих микроорганизмов, прежде всего, невысоких ростовых показателей и их требовательности к условиям среды. Вследствие этого, существование нитрифицирующих микроорганизмов в биопленках дает им ряд преимуществ, а именно, возможность накопления достаточного количества биомассы, повышенную активность биомассы, ввиду наилучших условий доступа субстрата и кислорода, защиту от стрессовых факторов окружающей среды.

Методы и материалы

В качестве объекта исследования в данной работе выступали активный ил городских очистных сооружений (МУП Водоканал) и нитрифицирующий микробиоценоз в его составе.

Накопительную культуру нитрифицирующих микроорганизмов получали методом Коха. В качестве селективных сред, для выявления нитрифицирующих бактерий использовались среды Виноградского.

Для выявления морфологических особенностей выделенных бактерий проводили окраску микробных препаратов по Граму. Идентификацию микроорганизмов осуществляли методом  флуоресцентной in situ гибридизации с использованием генных зондов на аммонийокисляющие бактерии бета(β)-группы протеобактерий, а также специфический зонд на нитритокисляющие бактерии Nitrobacter spp.  Для контроля всей совокупности микробных клеток в образцах биопленки использовалось окрашивание раствором 4`,6- диамидино-2-фенилиндолдигидрохлорида (DAPI). Микроскопирование образцов осуществлялось с помощью микроскопа Axio Imager D2 (Carl Zeiss, Germany).

Для оценки активности образования нитрифицирующих биопленок был применен модифицированный метод. В отличие от оригинальной методики, где выращивание биопленок происходит в луночных планшетах, биопленки выращивали в стеклянных пробирках в условиях непосредственного контакта бактериальной суспензии с образцами материала-носителя. Концентрация биомассы посевного материала составляла  3,5 × 106 КОЕ/мл. В качестве носителя использовались полиэтиленовые гранулы диаметром 4-6 мм.

Описание и обсуждение результатов

На основании анализа морфологических особенностей микроорганизмов в составе накопительной культуры нитрифицирующих бактерий для дальнейших исследований были выбраны бледные, белые, мелкие колонии, округлой формы для I фазы и мелкие полупрозрачные колонии, округлой формы для II фазы.

Согласно полученным данным, на средах Виноградского, элективных для I и II фазы, колонии микроорганизмов представлены грамотрицательными бактериями палочковидной формы, спор не обнаружено, что соответствует литературным данным о морфологических особенностях аммоний- и нитритокисляющих микроорганизмов (АОМ и НОМ).

Согласно результатам идентификации микроорганизмов методом флуоресцентной in situ гибридизации в составе накопительной культуры, выросшей на среде Виноградского (I фаза)  обнаружены практически одинаковое количество аммоний- и нитритокисляющих бактерий. Присутствие НОБ в составе накопительной культуры, выросшей на данной среде, вероятно связано с симбиотическими отношениями нитрификаторов двух групп, поскольку в результате жизнедеятельности АОБ образуются нитриты, используемые  НОБ в качестве субстрата.

В составе накопительной культуры, выросшей на среде Виноградского (II фаза) идентифицированы как АОБ, так и НОБ р. Nitrobacter.

Присутствие аммонийокисляющих микроорганизмов в составе накопительной культуры, выросшей на среде элективной для НОМ, вероятно определено тем, что нитрифицирующие бактерии обитают в сложном симбиозе между собой, поэтому трудно культивировать микроорганизмы I и II фазы отдельно друг от друга. Согласно литературным данным, для получения чистых культур необходимо несколько пересевов микроорганизмов на питательные среды, очевидно, что пяти последовательных  перевесов оказалось  недостаточно.

Анализ способности бактерий формировать биопленки на поверхности полиэтиленовых гранул свидетельствует об увеличении количества адгезированных клеток в течении 4 дней и их уменьшения по истечении 7 дней инкубирования.  Вероятно, это связано с тем, что в течение 4 дней инкубации биопленки достигают стадии зрелости, в результате деления клеток возникают компактные микроколонии, объединенные внеклеточным полимерным матриксом. По истечении 7 дней биопленка достигает критической массы, нарушается динамическое равновесие, происходит выделение и дисперсия микроорганизмов в окружающую среду.

Согласно полученным данным, наиболее выраженная способность к образованию биопленок на поверхности гранул отмечена при совместном культивировании нитрификаторов I и II фазы. Менее интенсивно формировали биопленку аммонийокисляющие микроорганизмы, что вероятно связано с более высокой скоростью роста нитритокисляющих бактерий. Также полученные результаты подтверждают известный факт, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида. 

Используемые источники
1. Биотехнология. Принципы и применение: пер. с англ / под. ред. И. Хиггинса
2. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студентов высших учебных заведений / под ред. А.И. Нетрусова
3. Гусев М.В. Микробиология: учебник для студ. биол. специальностей вузов
4. Возная Н.Ф. Химия воды и микробиология: учебное пособие для вузов
5. Гостев В. В. Бактериальные биоплёнки и инфекции
6. Жмур Н. С. Технологические и биохимические процессы очистки сточных вод на сооружениях с аэротенками
7. Nielsen P. H. FISH Handbook for Biological Wastewater Treatment. Identification and quantification of microorganisms in activated sludge and biofilms by FISH
8. Mendum T. A. Use of molecular and isotopic techniques to monitor the response of autotrophic ammonia oxidizing populations of the β-subdivision of the class Proteobacteriain arable soils to nitrogen fertilizer
Information about the project
Surname Name
Rakhmankulova Zilya
Project title
The analysis of nitrifying microorganisms ability to the biofilms formation
Summary of the project
The cumulative cultures of nitrifying microorganisms were obtained after repeated passaging of the activated sludge microbial community on the selective mediums. By fluorescence in situ hybridization were identified nitrifying microorganisms within received cumulative cultures.
Using the modified tablet method studied the ability of nitrifying microorganisms of I phase, II phase, and mix culture (I phase and II phase) to form biofilms.
Keywords
nitrifying microorganisms, nitrifying biofilms, biofilms formation, fluorescent in situ hybridization